干旱脅迫對(duì)桃葉杜鵑菌根苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響1)

熊賢榮 歐靜 龍海燕 歐陽嘉暉 熊丹

(貴州大學(xué)，貴陽，550025)

干旱脅迫對(duì)桃葉杜鵑菌根苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響1)

熊賢榮 歐靜 龍海燕 歐陽嘉暉 熊丹

(貴州大學(xué)，貴陽，550025)

為了探明ERM真菌在干旱脅迫時(shí)對(duì)桃葉杜鵑葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，在溫室大棚內(nèi)，采用盆栽控水法對(duì)分別接種兩種ERM真菌(TY29、TY35)的桃葉杜鵑1年生幼苗進(jìn)行干旱脅迫處理，以不接種真菌的為對(duì)照，在透射電鏡下觀測(cè)不同水分處理下接菌苗與對(duì)照苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明:在正常水分條件下，各處理桃葉杜鵑幼苗的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)相同，細(xì)胞完整。隨著干旱程度的加深，各處理細(xì)胞的葉綠體和線粒體的受損程度都逐漸增大，但在相同水分脅迫下，接種ERM菌根真菌的桃葉杜鵑幼苗的線粒體和葉綠體等細(xì)胞器的完整程度要高于對(duì)照，細(xì)胞器受損害程度更小，具有較好的抗旱能力，其中接種TY35對(duì)桃葉杜鵑葉肉細(xì)胞的作用更明顯。

桃葉杜鵑；ERM真菌；干旱脅迫；超微結(jié)構(gòu)

隨著全球氣候變暖，干旱災(zāi)害頻繁發(fā)生，植物的生長受到限制，植物如何在干旱環(huán)境中生存正成為研究熱點(diǎn)，有研究表明菌根真菌能與植物根系形成互惠共生體，對(duì)植物的生長發(fā)育和抗逆性有積極的影響，在改善植物水分代謝和提高植物耐旱性中發(fā)揮了重要作用[1]。隨著菌根真菌對(duì)植物的有益作用被研究的越來越多，其提高植物耐旱性作用也逐漸受到關(guān)注。

杜鵑花是我國傳統(tǒng)名花，有“花中西施”的美稱，高山杜鵑是其重要的類別之一，因其花序巨大，色彩鮮艷，株型美觀且葉常綠不凋而深受人們喜愛，可作為園林景觀、庭院栽培和盆花銷售，是城市園林景觀建設(shè)的優(yōu)良資源，國內(nèi)高山杜鵑種質(zhì)資源豐富，但可應(yīng)用栽培的種類少。桃葉杜鵑(RhododendronannaeFranch.)是高山杜鵑的代表種，其花色艷麗，花期5—7月，是一種觀賞價(jià)值較高的晚花類杜鵑，在景觀應(yīng)用上有巨大的市場(chǎng)潛力[2]，但其喜涼爽濕潤氣候，耐旱性較弱，制約其引種栽培，而接種杜鵑花類菌根(ERM)，對(duì)杜鵑花類植物克服惡劣環(huán)境、加強(qiáng)養(yǎng)分吸收起到重要的作用。歐靜等發(fā)現(xiàn)接種ERM顯著提高桃葉杜鵑幼苗的苗高、地徑、葉面積、主根長和生物量等，同時(shí)接種真菌后，桃葉杜鵑種子萌發(fā)時(shí)間有所提早，繁殖系數(shù)有較大提高[3-4]。本研究采用透射電子顯微鏡對(duì)干旱脅迫下桃葉杜鵑幼苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并設(shè)置不接種菌株的對(duì)照組CK，從微觀方面上更加深入了解ERM對(duì)植株作用，為ERM提高植物抗旱性研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

供試土壤按照V(腐殖質(zhì))∶V(石英砂)=3∶1的比例混勻后,經(jīng)121 ℃高溫高壓蒸汽滅菌2 h，滅菌后測(cè)得其土壤理化性質(zhì)為：pH=4.77，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)44.15 g/kg，全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.56 g/kg，全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.161 g/kg，有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.04 mg/kg，堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)268.55 mg/kg，速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)205.91 mg/kg。

供試植物為1年生桃葉杜鵑實(shí)生苗。采用播種繁殖，播種方法采用撒播，每盆100粒。供試的2個(gè)菌株為前期從野生桃葉杜鵑根系分離并篩選出的綜合促生能力和侵染率較強(qiáng)的2個(gè)菌株[4-5]:TY29(AB158314：Trametesochracea)，TY35(AB378554：Pochoniabulbillosa)(括號(hào)中前者為國際GenBank中的登錄號(hào)，后者為與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近種),由課題組分離保存。采用PDA液體培養(yǎng)基對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，置于搖床上28 ℃振蕩(160 r/min)暗培養(yǎng)15 d，打碎并制成液體菌劑備用。

于2015年12月播種后放入人工氣候箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)(晝夜都為25 ℃，濕度90%、光照12 h)。2016年4月，將桃葉杜鵑幼苗移出人工氣候培養(yǎng)箱，移栽至花盆中，每盆移植1株，栽植塑料花盆規(guī)格為90 cm×60 cm×80 cm，每盆裝滅菌土20 g，于2016年4月12日，每株幼苗根部各施入菌液5 mL，CK苗澆5 mL不含菌液的PDA液體培養(yǎng)基。在貴州大學(xué)林學(xué)院苗圃大棚內(nèi)進(jìn)行培育。同一個(gè)處理隨機(jī)擺放，各處理之間相互隔離，進(jìn)行常規(guī)育苗方法管理。

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2016年8月選取生長一致的植株進(jìn)行脅迫處理，每個(gè)處理15盆，每盆1株，各處理重復(fù)3次。用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素A為接菌處理，設(shè)3個(gè)處理，分別為TY29、TY35和對(duì)照CK；因素B為干旱脅迫處理，設(shè)4個(gè)脅迫梯度，按正常澆水(土壤含水率80%～90%，作為干旱脅迫的對(duì)照) 、輕度干旱(土壤含水率65%～75%) 、中度干旱(土壤含水率50%～60%)、重度干旱(土壤含水率35%～45%)進(jìn)行處理。每天下午通過稱質(zhì)量法維持土壤相對(duì)含水量保持在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，其他管理一致，每天傍晚補(bǔ)足白天損失的水分，連續(xù)處理30 d后測(cè)定各指標(biāo)。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

2016年8月對(duì)菌根侵率進(jìn)行測(cè)定，植株收獲時(shí)菌根侵染率按Phillips[6]方法測(cè)定,涉及到的計(jì)算公式如下：

菌根侵染率=(菌根侵染的根段數(shù)量/檢測(cè)的根段總數(shù)量)×100%;

菌根依賴性=(接種植株平均干質(zhì)量/對(duì)照植株平均干質(zhì)量)×100%；

菌根貢獻(xiàn)率=((接種植株平均干質(zhì)量-不接種植株平均干質(zhì)量)/接種植株平均干質(zhì)量)×100% 。

1.3 樣品的制備與觀察

取材與固定：水分脅迫30 d后，取各處理幼苗中間部位、大小相近的葉片，沿葉片中部(避開主脈)切取大小1 mm×1 mm的小塊，將樣品放入2.5%的戊二醛溶液中，在4 ℃條件下固定24 h以上。然后用pH為7.2的磷酸緩沖溶液進(jìn)行漂洗，再用1%的鋨酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行后固定，在0～4 ℃條件下固定24 h。

制片與觀察：將樣品取出，用pH為7.2的磷酸緩沖溶液進(jìn)行漂洗，然后用1%的鋨酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行后固定，在0～4 ℃條件下固定24 h。再用pH為7.2的磷酸緩沖溶液漂洗3次，每次25 min，再經(jīng)過30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇脫水，每級(jí)停留30 min，然后用環(huán)氧丙烷置換過渡，Epon812滲透包埋，經(jīng)超薄切片機(jī)切片后，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛對(duì)染，最后置于透射電鏡在Hu212A透射電鏡下觀測(cè)其中柱細(xì)胞并拍照(桃葉杜鵑細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)制片與拍照均在上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根侵染率、菌根依賴性和菌根貢獻(xiàn)率

由表1可見，不同ERM菌株接種桃葉杜鵑幼苗，其菌根侵染率差異明顯，其中TY35的侵染率最高為45%，TY29的侵染率為27.5%，未接種的CK處理幼苗根系侵染率為0，極顯著低于接種處理幼苗根系的侵染率。接種苗的菌根依賴性均大于100%，TY35達(dá)到147.89%；接種幼苗的菌根貢獻(xiàn)率為13.65%～32.38%。

表1 不同菌株接種桃葉杜鵑幼苗的菌根侵染率 %

注：表中數(shù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2 正常水分條件下的葉片超微結(jié)構(gòu)

正常水分條件下，對(duì)照處理與接菌處理的葉肉細(xì)胞無結(jié)構(gòu)差異，細(xì)胞呈橢圓形或長橢圓形，細(xì)胞質(zhì)壁結(jié)合較緊密，細(xì)胞膜平滑，清晰可見，內(nèi)含葉綠體較多，且多呈梭形分布在細(xì)胞的邊緣，緊貼著細(xì)胞壁，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰、完整，類囊體豐富，片層結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)，且排列整齊，葉綠體結(jié)構(gòu)上還分布著大小不一的白色淀粉粒以及嗜鋨顆粒。線粒體多呈較規(guī)則的圓形分布在細(xì)胞周圍，結(jié)構(gòu)完整，外膜清晰可見，內(nèi)部電子密度較高，內(nèi)嵴較豐富(圖1)。

2.3 輕度脅迫條件下的葉片超微結(jié)構(gòu)

輕度脅迫下，各處理苗的葉肉細(xì)胞產(chǎn)生了不同的變化，與正常水分相比，CK處理植株的葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁有增厚現(xiàn)象，細(xì)胞膜變得模糊、扭曲，細(xì)胞質(zhì)凝聚成許多纖維狀顆粒體，均勻散布在細(xì)胞內(nèi)，葉綠體及各細(xì)胞器開始向細(xì)胞中央移動(dòng)，不再貼壁分布(圖2，d1)，葉綠體數(shù)量明顯減少，發(fā)生腫脹變形，向內(nèi)皺縮，類囊體片層開始膨脹(圖2，d2)，淀粉邊緣糊化，少數(shù)發(fā)生降解，嗜鋨顆粒數(shù)量開始增多。線粒體體積增大，外膜輪廓變得模糊，細(xì)胞著色較淺，內(nèi)部嵴的數(shù)量變少(圖2，d3)。TY29處理植株的葉肉細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)基本完整(圖2，e1)，部分葉綠體發(fā)生變形，類囊體片層結(jié)構(gòu)膨脹，嗜鋨顆粒數(shù)量開始增多(圖2，e2)，線粒體數(shù)量開始增多，外膜結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)部變化并不明顯(圖2，e3)。TY35處理植株的變化如圖所示，細(xì)胞壁稍有增厚，膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞質(zhì)壁貼合緊密，細(xì)胞質(zhì)也凝聚成許多纖維狀顆粒體(圖2，f1)，葉綠體變化較小，僅少數(shù)葉綠體發(fā)生腫脹，嗜鋨顆粒變化不明顯(圖2，f2)。

a1～a3分別為CK處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；b4～b6分別為TY29處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；c7～c9分別為TY35處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體。

圖1正常水分條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.4 中度脅迫條件下的葉片超微結(jié)構(gòu)

隨著脅迫加劇，各處理苗的葉肉細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步發(fā)生改變，CK處理植株的細(xì)胞形態(tài)變化最為明顯，葉肉細(xì)胞因失水嚴(yán)重變形，扭曲，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)許多深色物質(zhì)凝聚在細(xì)胞邊緣(圖3，g1)，葉綠體進(jìn)一步腫脹，葉綠體膜系統(tǒng)受到破壞，外膜消失，片層結(jié)構(gòu)模糊不清，有的基粒片層膨脹、溶解或空泡化，類囊體發(fā)生斷裂，多數(shù)淀粉粒降解，嗜鋨顆粒增多且有大的嗜鋨顆粒出現(xiàn)(圖3，g2)。線粒體的外膜破裂，嵴消失，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊(圖3，g3)。TY29處理植株的葉肉細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，外部細(xì)胞壁出現(xiàn)破損，細(xì)胞膜變得模糊，各細(xì)胞器之間界限模糊(圖3，h1)，葉綠體外被膜局部破裂，有部分內(nèi)含物外流，基粒和基質(zhì)類囊體膜結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，嗜鋨顆粒增多(圖3，h2)。線粒體外膜輪廓變得模糊，細(xì)胞著色較淺，內(nèi)部嵴減少(圖3，h3)。中度脅迫下，TY35處理植株的葉肉細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)未受到破壞，細(xì)胞膜基本完整，細(xì)胞內(nèi)有大量纖維狀顆粒物質(zhì)產(chǎn)生(圖3，i1)，葉綠體腫脹明顯，體積變大或近球形，與細(xì)胞壁發(fā)生分離，類囊體空腔膨大，基粒片層排列散亂，有較多嗜鋨顆粒出現(xiàn)(圖3，i2)。線粒體外膜結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)部嵴減少(圖3，i3)。

d1～d3為CK處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；e1～e3為TY29處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；f1～f3為TY35處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體。

圖2輕度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

g1～g3為CK處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；h1～h3為TY29處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；i1～i3為TY35處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體。

圖3中度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.5 重度脅迫條件下的葉片超微結(jié)構(gòu)

重度干旱脅迫下，各處理苗的葉肉細(xì)胞均出現(xiàn)一定的空泡化，以CK處理植株的最為嚴(yán)重，大部分細(xì)胞器發(fā)生降解，細(xì)胞呈不規(guī)則狀(圖4，j1)，僅有少數(shù)葉綠體分布，有的葉綠體已經(jīng)發(fā)生降解，只殘存零碎的類囊體片段或降解物，嗜鋨顆粒減少(圖4，j2)。線粒體內(nèi)含物流出，部分降解(圖4，j3)。TY29處理植株的葉肉細(xì)胞也呈不規(guī)則狀，但細(xì)胞內(nèi)仍有一定數(shù)量的葉綠體分布(圖4，k1)，葉綠體外膜消失，形狀扭曲變形，內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞內(nèi)淀粉粒數(shù)量較多，但邊緣逐漸糊化(圖4，k2)，線粒體發(fā)生膨脹變形，外膜結(jié)構(gòu)已消失，內(nèi)部嵴減少且結(jié)構(gòu)模糊不清(圖4，k3)。相較之下，TY35處理植株的葉肉細(xì)胞仍然較為完整，外部沒有發(fā)生明顯變形，膜結(jié)構(gòu)受損，殘存有細(xì)胞器降解之后的殘骸(圖4，l1)，葉綠體明顯腫脹、形態(tài)不規(guī)則，類囊體片層排列紊亂，但仍有較多嗜鋨顆粒分布(圖4，l1)。線粒體外膜輪廓變得模糊，細(xì)胞著色較淺，內(nèi)部嵴發(fā)生斷裂(圖4，l1)。

j1～j3為CK處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；k1～k3為TY29處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體；l1～l3為TY35處理植株的葉肉細(xì)胞、葉綠體、線粒體。

圖4重度脅迫條件下的桃葉杜鵑幼苗葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

3 討論

在水分虧缺條件下，菌根植物能從土壤中吸收更多的水，使菌根植物受到較少的脅迫，比非菌根植物更耐旱，在逆境來臨時(shí)可提高植株對(duì)逆境環(huán)境的抵抗能力[7-8]。植物的葉片對(duì)環(huán)境的反應(yīng)最為敏感，環(huán)境的改變?nèi)菀赘淖兯男螒B(tài)結(jié)構(gòu)，植物受到干旱脅迫時(shí)，植物細(xì)胞中的葉綠體和線粒體是對(duì)干旱脅迫比較敏感，所負(fù)擔(dān)的生理功能較為重要的兩個(gè)細(xì)胞器，在逆境脅迫下，它們的正常結(jié)構(gòu)及功能的維持對(duì)植物抵抗逆境能力的大小起著至關(guān)重要的作用[9]。本試驗(yàn)中，在正常水分條件下，各處理幼苗的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相同，細(xì)胞器也無明顯差異。在輕度脅迫下，CK苗的葉綠體發(fā)生腫脹變形，向內(nèi)皺縮，類囊體片層開始紊亂，TY29的葉綠體膨脹變圓，而TY35的變化相對(duì)較小，表明接種ERM的桃葉杜鵑葉綠體對(duì)水分脅迫具有一定的耐受性，葉綠體出現(xiàn)腫脹縮短、體積變大等現(xiàn)象可能是為了減少光線的直接穿透量和受光面積，避免高溫缺水的灼傷，這是葉綠體對(duì)逆境脅迫的生理適應(yīng)性反應(yīng)[10]。隨著脅迫程度加重，CK葉肉細(xì)胞進(jìn)一步受損，葉綠體解體并出現(xiàn)空泡化，菌根苗的葉綠體膨脹變形，片層結(jié)構(gòu)斷裂，但其受損程度輕于對(duì)照。莫言玲[11]對(duì)西瓜的研究也有相同的結(jié)果，干旱處理下，菌根西瓜葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)比非菌根植株葉片的排列更整齊、更有序，非菌根植株葉綠體的損傷也更為明顯。輕度脅迫時(shí)，線粒體的變化并不明顯，隨著脅迫加劇，葉肉細(xì)胞和根系細(xì)胞內(nèi)的線粒體都表現(xiàn)為數(shù)量的增加，嵴變少，外膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，嚴(yán)重脅迫時(shí)線粒體降解并空泡化，但不同菌株處理之間傷害表現(xiàn)具有差異性，CK線粒體的損傷程度均大于菌根苗，在水分脅迫下也較早發(fā)生降解，干旱脅迫后線粒體數(shù)目增多，可能是對(duì)單位線粒體活性降低的補(bǔ)償，從而保證脅迫過程中能量的供應(yīng)[12]。在逆境脅迫下，線粒體的結(jié)構(gòu)較葉綠體穩(wěn)定，且受損傷晚于葉綠體[13]，這與徐萍等[14]對(duì)銀沙槐幼苗，任麗花等對(duì)圓葉決明的研究結(jié)果相似[15]。

4 結(jié)論

干旱脅迫對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷影響是一個(gè)漸進(jìn)的過程，隨著脅迫程度的加強(qiáng)，細(xì)胞失水加劇，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)愈加明顯，干旱脅迫引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，是植物受到傷害的共同特征，其破壞程度取決于植物的抗旱性強(qiáng)弱[16]。 在不同水分條件下，桃葉杜鵑幼苗接種菌根真菌后，葉肉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)要比不接菌更加完整，干旱脅迫顯著影響桃葉杜鵑幼苗的葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。隨著脅迫加劇，幼苗的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷不斷加重，接種不同的ERM對(duì)桃葉杜鵑幼苗抗旱性影響不同，接種TY35的菌根幼苗受旱害程度要小于接種TY29的菌株幼苗，但CK苗葉肉細(xì)胞的細(xì)胞器的受損程度均較菌根苗嚴(yán)重，即接種ERM真菌在干旱脅迫下能有效的保護(hù)桃葉杜鵑的葉肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

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EffectsofEricoidMycorrhizaFungionRhododendronannaeSeedlingsLeafUltrastructureunderDroughtStress

Xiong Xianrong, Ou Jing, Long Haiyan, Ouyang Jiahui, Xiong Dan

(Guizhou University, Guiyang 50025, P. R. China)Journal of Northeast Forestry University，2017,45(12)：38-43.

Rhododendronannae; ERM; Drought stress; Ultra-structure

1)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560223、31460136)；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合支撐[2016]2522號(hào))；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(研農(nóng)2017010)。

熊賢榮，女，1992年2月生，貴州大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:907188554@qq.com。

歐靜，貴州大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:coloroj@126.com。

2017年6月1日。

潘 華。

S688.9

An experiment was conducted to study the effects of Ericoid Mycorrhiza Fungi on leaf ultrastructure of 1-a seedlings ofRhododendronannaeunder water stress by soil culture experiment. Under drought stress in the greenhouse, the effects on root cells ultrastructures ofR.annaemycorrhizal seedlings were studied. Under normal water condition, the ultrastructure of mesophyll cells was complete. All cell chloroplasts and mitochondria damage were increased gradually, but under the same water stress, inoculated seedlings of cell organelles such as mitochondria and chloroplasts were more stable than control, and TY35 was more apparent in the role of the mesophylls.