QuEChERS-HPLC-MS/MS測定動物源性食品中蟲酰肼殘留量

王曉晗 ，劉 鵬 ，楊 晨 ，楊長志 *

（1.黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱150028）

QuEChERS-HPLC-MS/MS測定動物源性食品中蟲酰肼殘留量

王曉晗1，劉 鵬2，楊 晨2，楊長志2*

（1.黑龍江煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150010；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱150028）

本文建立了動物源性食品中蟲酰肼殘留量分析方法。樣品以乙酸乙腈溶液（1∶99，V/V）為提取劑，經(jīng)高速勻漿方法提取，樣液經(jīng)過N-丙基乙二胺和十八烷基硅烷凈化后，去除樣液中脂肪酸、極性色素等極性基質(zhì)雜質(zhì)，以乙腈-乙酸-水溶液（梯度洗脫）為流動相經(jīng)ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，粒度1.7 μm）進(jìn)行分離后，進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析并確證，外標(biāo)法定量。方法的相關(guān)系數(shù)（r）為0.9933，最低檢出限為 1μg·kg-1。在 3 種（1、50、25000μg·kg-1）添加水平下，其平均回收率在 79.0%～103.0% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%（n=6）。本方法是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的分析動物源性食品中蟲酰肼殘留量的檢測方法。

蟲酰肼；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；動物源性食品

O657.6

蟲酰肼（Tebufenozide），別名為米螨（Mimic），是一種新穎的蛻皮激素類殺蟲劑，通過干擾昆蟲的正常發(fā)育使害蟲蛻皮而死。該藥1994年獲得我國的行政保護(hù),并進(jìn)入了中國市場,在蔬菜、水稻、棉花以及林業(yè)病蟲害防治方面得到了大面積推廣應(yīng)用。蟲酰肼對眼睛和皮膚無刺激性，雖然對高等動物無致畸、致癌、致突變作用，對哺乳動物、鳥類、天敵均十分安全，但其廣泛應(yīng)用可能對人類造成潛在的健康威脅和生態(tài)環(huán)境的污染和破壞。

目前，日本、美國、歐盟等許多發(fā)達(dá)國家對豬肉中蟲酰肼的殘留提出了嚴(yán)格限量要求，最高殘留限量規(guī)定為0.08～0.02mg·kg-1。而目前對蟲酰肼殘留的研究多集中在茶葉、水果、蔬菜和糧谷等基質(zhì)的檢測[2-10]，關(guān)于動物源性食品基質(zhì)中蟲酰肼殘留的檢測報道不多。龐國芳等[11]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究了動物肌肉中461種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T20772-2008）中包含有蟲酰肼的測定，其檢測限為0.004mg·kg-1，該國家標(biāo)準(zhǔn)是多殘留方法，其前處理比較復(fù)雜、耗時多，使用起來不太方便。因此，本文建立了一種以改良的QuEChERS[4,12-14]基質(zhì)分散方法進(jìn)行凈化，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[13-15]檢測動物源性食品中蟲酰肼殘留量。該方法具有操作方便、分析速度快、靈敏度高、選擇性強、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點，對于彌補該農(nóng)藥檢測方法的不足、解決國外貿(mào)易技術(shù)壁壘、推動食品安全又快又好的發(fā)展具有一定的參考意義。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

取有代表性豬肉樣品約1000g，將其可食部分切碎后，用組織搗碎機將充分搗碎均勻，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標(biāo)明標(biāo)記，于－18℃以下保存。

乙腈（HP）；乙酸（GR）；乙酸鈉（AR）；NaCl（AR）；無水 Na2SO4(AR（650℃灼燒 4h，貯于密封干燥器中備用）；蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)品 (純度大于99%德國DR公司）。

N-丙基乙二胺（PSA）吸附劑（40～100μm）、十八烷基硅烷（ODS）鍵合相（40～100μm），北京安捷飛科技有限公司。實驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀（Quattro Premier美國Waters公司）；高速勻漿機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國IKA公司；高速離心機；IKA MS3旋渦混合器；Organomation N-EVAP112氮吹儀；IKAT25均質(zhì)器。

1.3 分析條件

色譜柱：BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm）；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%乙酸水溶液；梯度洗脫：0.00～2.00 min:70%A，30%B；2.00～4.00 min:70%～100%A，30%～0%B；4.00～4.50min:100%～70%A，0%～30%B；4.50～5.00min:70%A,30%B。流速 0.25mL·min-1；柱溫 25℃；進(jìn)樣量 10μL。

電噴霧離子源：正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：3.0kV；錐孔電壓：12V；碰撞氣能量（eV）：16，8；離子源溫度：120℃；去溶劑器溫度：350℃；去溶劑氣流量：500L·h-1；錐孔氣流量：50L·h-1；定性離子對（m/z）：353.1/133.1，353.1/297.1；定量離子對（m/z）：353.1/297.1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取適量的蟲酰肼農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，此溶液轉(zhuǎn)移至儲液瓶中避光-18℃下可儲存6個月；根據(jù)需要使用前再用空白樣品基質(zhì)逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.0004、0.002、0.010、0.04μg·mL-1和 0.5000μg·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.5 樣品前處理

稱取5g絞碎均勻的樣品于50mL的聚丙烯離心管中，加入10mL水、3g無水MgSO4、1gNaCl和1g乙酸鈉，再加入15mL乙酸-乙腈（1:99，V/V）溶液，用勻漿機高速均質(zhì)2min，然后在4000r·min-1離心機上離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中。再用10mL乙酸-乙腈（1∶99，V/V）溶液重復(fù)提取一次，合并提取液于同一25mL容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，用于下一步凈化。

用移液管移取7mL上述提取液于15mL聚丙烯具塞離心管中，加入300mg無水MgSO4、250mg N-丙基乙二胺（PSA）吸附劑和500mg十八烷基硅烷（ODS）鍵合相，在混合器上混合2min，然后在4000r·min-1離心機上離心 5min。

準(zhǔn)確移取5mL凈化液于15mL刻度試管中，在50℃條件下氮氣吹至近干，用流動相定容至溶解并定容至1.0 mL，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的選擇

該化合物是一種熱不穩(wěn)定化合物，采用氣相色譜法測定其殘留量很難實現(xiàn)；液相色譜法雖然也能測定，但方法靈敏度達(dá)不到要求；國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T20772-2006）中采用LC-MS/MS法測定食品中蟲酰肼殘留量，其方法的檢測限為4μg·kg-1，雖然能滿足國外限量要求，但在實際工作中往往都是測定食品中單一農(nóng)藥殘留，所以其適用性不強。為了能滿足國外有關(guān)動物源性食品中蟲酰肼殘留限量（80～20μg·kg-1）要求，本文最后選用液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜開展研究工作，經(jīng)實驗表明，其方法檢測限達(dá)為 1μg·kg-1。

2.2 提取劑的選擇

根據(jù)蟲酰肼農(nóng)藥化合物結(jié)構(gòu)特點，結(jié)合其易溶于有機溶劑化學(xué)特性，本文采用了Anastassiades和Lehotay等［16］的探討的前處理方法，用乙酸-乙腈（1∶99，V/V）對動物源性食品進(jìn)行提取，乙腈提取時，分層更加明顯，即乙腈的鹽析效果好于甲醇，更有利于提取的分層，故選擇酸性乙腈為提取劑。

2.3 凈化方法的選擇和優(yōu)化

分散固相萃取的凈化吸附劑有很多種類，選擇兩種離子交換吸附劑(PSA、ODS)和石墨化碳惰性吸附劑進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，石墨化碳對動物源性食品中色素的吸附作用不大，沒有采用。通過P SA和ODS的組合進(jìn)行優(yōu)化實驗，P SA和ODS吸附劑組合的凈化效果最好。當(dāng)PSA用量高于250mg，ODS高于500mg時，凈化溶液中顏色無明顯變化，考察其對回收率影響也不大。當(dāng)吸附劑組合用量PSA低于250mg，ODS低于500mg時，提取液含雜質(zhì)較多，顏色呈現(xiàn)黃色，會影響測定的準(zhǔn)確度，故吸附劑的用量最終選擇PSA250mg+ODS500mg較為合適。從譜圖2、3可以看出，凈化后蟲酰肼目標(biāo)物周圍無雜質(zhì)峰干擾。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of the tebufenozide standard

圖2 豬肉樣品添加1μg·kg-1色譜圖Fig.2 Chromatogram of spiked pig meat sample at 1μg·kg-1

圖3 豬肉樣品空白色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank pig meat sample

2.4 方法的線性范圍及檢出限

取系列濃度 0.0004、0.002、0.010、0.04μg·mL-1和0.5000μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述色譜條件每種濃度進(jìn)樣l0μl，以峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，以實際添加水平測定方法最低檢出限，得回歸方程：Y=9174.36X+2219.55，r=0.9933（n=5）。表明在 0.0004～0.5000μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限為1μg·mL-1。

2.5 方法的準(zhǔn)確度及精密度實驗

選取豬肉樣品，分別準(zhǔn)確稱取5.0g勻漿進(jìn)行1、50、25000μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)的添加實驗，結(jié)果見表1。

表1 豬肉中添加蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果（n=6）Tab.1 Result of determination for tebufenozide in pig meat spiked at 3 levels(n=6)

不同添加濃度的回收率測定范圍在79.0%～103.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.57%～9.18%，均小于10%，其結(jié)果表明方法的準(zhǔn)確度及精密度均可達(dá)到殘留定量分析的要求。

3 結(jié)論

本研究建立的HPLC-MS/MS測定方法，樣品前處理采用QuEChERS檢測技術(shù),提取效率高、凈化效果好，條件易于控制，節(jié)約試劑和成本，減少對環(huán)境污染，極大地縮短了分析檢測時間，提高了工作效率，利于樣品的快速分析。本方法的回收率、精密度和檢出限優(yōu)于文獻(xiàn)報道值和原有的標(biāo)準(zhǔn)，能夠滿足國外對動物源性食品中蟲酰肼限量檢測的要求。

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Determination of tebufenozide residues in foodstuffs of animal origin by QuEChERS and HPLC-MS/MS

WANG Xao-han1，LIU Peng2，YANG Chen2，YANG Chang-zhi2*
（1.Heilongjiang Tobacco Industry Co.，Ltd.，Harbin 150010，China；2.Heilongjiang Entry&Exit Inspection and Quarantine Bureau，Harbin 150028，China）

A method has been developed for the determination of tebufenozide residues in foodstuffs of animal origin.Samples were extracted with acidic acid-acetonitrile （1∶99，V/V）after high-speed homogenization.The crude extract was purified on N-propyl ethylenediamine and octadecylsilane to remove fatty acid and polar pigment by complex matrix in samples.The tebufenozide residue was separated on ACQUITY UPLC BEH C18（50mm×2.1 mm，1.7μm）column using acetonitrile-acetic acid-aqueous solution water as the mobile phase by gradient elution and detected using for mass spectrometry analysis and confirmation，and quantified by external standard method.The developed method exhibited an excellent linear relationship （r＞0.9933）and a detection limit of 1μg·kg-1.At the spiked levels of 1，50 and 25000μg·kg-1，the average recovery rates for tebufenozide were in the range of 79.0%～103.0%with a relative tandarddeviation（RSD）of less than 10%（n=6）.This method proved rapid，accurate and highly sensitive and can therefore be used for the determination of tebufenozide residue in foodstuffs of animal origin.

tebufenozide；LC-MS/MS；foodstuffs of animal origin

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171237

2017-11-06

王曉晗（1967-），女，工程師，畢業(yè)于哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)專業(yè)，本科，研究方向：煙草及食品安全檢測技術(shù)。

導(dǎo)師簡介：楊長志(1962-)，男，研究員，碩士，研究方向：食品安全檢測技術(shù)。