辣蓼揮發(fā)油GC-MS分析及抗菌效果考察*

王 悅 ，于天穎 ，王知斌 ，王秋紅 ，2，匡海學 *

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 1500402；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006）

辣蓼揮發(fā)油GC-MS分析及抗菌效果考察*

王 悅1，于天穎1，王知斌1，王秋紅1，2，匡海學1*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 1500402；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006）

目的分析和鑒定辣蓼中揮發(fā)油的化學成分，并檢測其抗菌效果，以便更合理地開發(fā)利用辣蓼資源。方法采用水蒸汽蒸餾法提取辣蓼揮發(fā)油，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分離和鑒定其化學成分，并用峰面積歸一化法測定了各組分的相對含量。通過體外抗菌實驗檢測辣蓼揮發(fā)油的抗菌效果。結果從辣蓼揮發(fā)油中分離并鑒定出39個組分，占揮發(fā)油總量的82.31%。體外抗菌實驗表明，其對多種致病菌起到良好的抗菌效果。結論 本實驗為進一步研究辣蓼揮發(fā)油奠定理論基礎，為深度開發(fā)和利用辣蓼資源，提供科學依據(jù)。

辣蓼；揮發(fā)油；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；化學成分；抗菌

S567；R284.1

辣蓼為蓼科蓼屬水蓼（Polygonumhydropiper L.）的干燥全草。味辛、性溫，具有健脾化濕、除濕化滯、止痢止痛、解毒化瘀等功效。分布廣泛，多生于河灘、水溝邊、山谷濕地，海拔50～3500m處。古代常將其作為調(diào)味劑，我國民間常作止瀉劑、調(diào)味品、蚊蟲煙熏劑、糧倉驅蟲劑等[1，2]?！缎滦薇静荨分杏涊d：“水蓼，主蛇毒，搗敷之。絞汁服，止蛇毒入內(nèi)心悶。水煮漬捋腳，消氣腫。葉似蓼，莖赤，味辛，生下濕水旁”[3]。《本草綱目》記載:“蓼苗葉，辛、溫、無毒”[4]?！锻饪茊⑿吩唬骸磅r蓼草，10斤曬干燒灰存性淋灰汁熬膏子半碗聽用”[5]?，F(xiàn)代研究表明，辣蓼中含有黃酮、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、脂肪酸、萜類、蒽醌、糖苷等化學成分；具有抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛及殺蟲、抗生育、酪氨酸酶抑制等作用；主要用于治療風濕關節(jié)痛、跌打腫痛、疥癬、腹瀉、腸胃炎、痢疾、功能性子宮出血、腳氣等；外用治皮膚濕疹、毒蛇咬傷等[6，7，8]。

揮發(fā)油是辣蓼的活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，辣蓼中含有一系列具有drimane骨架的揮發(fā)油化合物，其中具有drimane骨架的蓼二醛等倍半萜類化合物是辣蓼殺蟲的有效成分[9]。水蒸汽蒸餾法是提取揮發(fā)油的經(jīng)典方法。目前，最常用的體外抗菌實驗為微量稀釋法，其主要目的是測定藥物的最低抑菌濃度，并依據(jù)數(shù)值的大小評定其藥效的強弱，此方法的優(yōu)點是靈敏度高、定量性好，易于實現(xiàn)自動化。本文利用水蒸汽蒸餾法提取辣蓼中的揮發(fā)性成分，采用GC-MS分析其化學成分，并通過微量稀釋法測定其抗菌效果。為推動辣蓼植物資源的開發(fā)與利用，提供實驗依據(jù)并奠定理論基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；7693型自動進樣器（美國Agilent公司）；5975C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；NIST標準質(zhì)譜圖（美國Finnig公司）；DB-1701毛細管色譜柱（60mm×0.25mm×0.25μm）；賽多利斯BT25S天平（Sartorius，1/10萬）；II級生物安全柜（美國NUAIRE公司）；YXQ-LS壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；LRHS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

無水Na2SO4（AR）；水為重蒸水；載氣為高純He（99.99%）；甲醇（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；其他試劑均為分析純；牛肉膏、蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術有限責任公司）；二甲基亞砜（天津市凱通化學試劑有限公司）。

藥材購于三棵樹藥材市場，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學王振月教授鑒定為水蓼（P.hydropiper L.）的干燥全草。

大腸桿菌、白葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、檸檬葡萄球菌、乙型副傷寒桿菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏痢疾桿菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌，以上菌株均由黑龍江中醫(yī)藥大學微生物與免疫學教研室提供。

1.2 揮發(fā)油的提取

稱取干燥的辣蓼藥材100g，置于2000mL圓底燒瓶中，加入1000mL蒸餾水浸泡1h，于電熱套中保持微沸回流提取7h，得到淡黃色透明狀揮發(fā)油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后得21.8mg，置于4℃冰箱備用。

1.3GC-MS分析條件

1.3.1 氣相條件 DB-1701（60mm×0.25mm×0.25μm）高效毛細管色譜柱；程序升溫：初始溫度50℃，保持6min，以6℃·min-1升至 120℃，再以 3℃·min-1升至260℃，保持5min，總分析時間為69.333min；分流比 2∶1；進樣量 1μL；載氣：高純 He。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電離方式：EI源；電子能量70eV；離子源溫度230℃；質(zhì)譜接口溫度280℃；質(zhì)量掃描范圍 m/z：20～550，全掃描模式；溶劑延遲 6min。

1.4 體外抗菌實驗

1.4.1 菌液的制備 將菌種接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃孵育24h使菌株復蘇。復蘇后，再接種于5mL培養(yǎng)基中，于37℃孵育18h后，取500μL至4.5mL培養(yǎng)基中，37℃孵育6h，按上一步操作重復稀釋兩次，制備1∶1000的稀釋菌液供實驗使用。

1.4.2 最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）及最低殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）測定 采用96孔板連續(xù)稀釋法。37℃培養(yǎng)18h。沒有細菌生長（即未變混濁）的孔所對應藥液的最低濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

采用瓊脂板劃分區(qū)域法，將上述澄清的的各菌藥混合液分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，并觀察細菌生長情況。沒有細菌生長的最低藥液濃度即為最低殺菌濃度（MBC）。

2 結果與分析

2.1 辣蓼揮發(fā)油成分的分析與鑒定

采用GC-MS對辣蓼揮發(fā)油的化學成分進行分析，得到樣品的總離子流圖（圖1），共分離得到56個組分，將各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)在NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并結合相關參考文獻，共鑒定出39個化合物，采用峰面積歸一法計算各組分的相對含量，結果見表1。

圖1 辣蓼揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of the essential oil from P.hydropiper L

在鑒定出的39個化合物中含量較高的揮發(fā)油成分主要有：香薷酮、Methyl 9-（Z）-octadecenoate、（+）-b-Selinene、植酮、β- 桉葉醇、4，6-Quinolinediamine、（+）-α- 長 葉 蒎 烯 、 氧 化 石 竹 烯 、（Z）-Cinerone、異香橙烯環(huán)氧化物等。

表1 辣蓼揮發(fā)油化學成分的GC-MS分析結果Tab.1 Analysis of chemical components of the volatile oil from P.hydropiper L

2.2 辣蓼揮發(fā)油的抗菌結果

采用微量稀釋法考察辣蓼揮發(fā)油的抗菌效果。結果顯示，辣蓼揮發(fā)油對于多數(shù)菌種具有表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，結果見表2。

表2 辣蓼揮發(fā)油的體外抗菌作用（±S）Tab.2 Antimicrobial activity of volatile chemical constituents from P.hydropiper L.in vitro（ ±S）

辣蓼揮發(fā)油對檸檬葡萄球菌、乙型副傷寒桿菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏痢疾桿菌、痢疾桿菌具有顯著地抑制作用。

3 結論

香薷酮具有抗氧化、抗菌活性，抗菌譜較廣，對葡萄球菌、乙型鏈球菌、傷寒桿菌等均有作用。植酮為維生素E醋酸酯的中間體。β-桉葉醇具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗電休克癲癇樣驚厥和抗抑郁等中樞神經(jīng)性藥理作用，同時可抑制胃酸分泌、調(diào)節(jié)胃腸運動，且在保護肝細胞等方面表現(xiàn)出良好活性[10]。以上化合物為辣蓼揮發(fā)油的主要成分，其可能為辣蓼的活性成分，但還需進一步的研究。

辣蓼是一種傳統(tǒng)的中草藥，其資源豐富，臨床應用廣泛。但在種質(zhì)資源、飲片加工生產(chǎn)、藥材質(zhì)量標準等方面的研究不夠深入，對化學成分及藥理藥效學等缺乏系統(tǒng)性的研究。同時應注意到辣蓼在醫(yī)藥、植物源農(nóng)藥、獸藥、食品添加劑等方面表現(xiàn)出的巨大開發(fā)潛力和研究價值[11]。結合其抗菌、抗氧化、抗病毒、鎮(zhèn)痛及殺蟲等藥理作用，合理開發(fā)新型產(chǎn)品，同時還可考慮生產(chǎn)其他增值產(chǎn)品，以提高辣蓼的綜合利用率，如可將藥材殘渣生產(chǎn)各種紙張及三合板等。因此，我們需要確定辣蓼的種質(zhì)資源，制定規(guī)范的藥材質(zhì)量標準，以確保其藥材質(zhì)量，同時深入研究辣蓼的作用機理，并尋求其藥效物質(zhì)基礎，為開發(fā)新型藥物、抗衰老和抗疲勞的天然保健品、植物源殺蟲劑及獸藥等提供理論依據(jù)，以此加強辣蓼資源的開發(fā)利用及綜合利用。

［1］ 中國植物志［M］.1998.

［2］ 劉信平，張馳，譚志偉，等.辣蓼揮發(fā)性活性成分的GC/MS研究［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2009，26（4）:285-288.

［3］ 唐蘇敬.新修本草（第十一卷）［M］.

［4］ 明李時珍.本草綱目（草部，第十六卷）［M］.

［5］明申斗垣.外科啟玄.（卷之十一）［M］.

［6］ 黃紅泓，甄漢深.中草藥辣蓼近年來的研究進展［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2013，（1）:38-40.

［7］ 胡曬平，劉強，劉楊，等.辣蓼的研究概述［J］.中華中醫(yī)藥學會中藥化學分會第九屆學術年會論文集，2014年7月9-18日.

［8］ 楊新周，郝志云，朱以常，等.辣蓼不同部位的抗氧化活性［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（2）:284-285.

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［11］ 何立美，陳玉婷，劉洪梅，等.高效液相色譜法同時測定水辣蓼提取物中6種黃酮成分的含量［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2014，13:94-98.

GC-MS analysis and antibacterial effect of volatile oil in Polygonum hydropiper*

WANG Yue1，YU Tian-ying1，WANG Zhi-bin1，WANG Qiu-hong1，2，KUANG Hai-xue1*
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Key Laboratory of Chinese Materia Ministry of Education，Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine Pharmacodynamics Bases，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective:To analyze and identify the chemical constituents of volatile oil in Polygonum hydropiper，and to test its antibacterial effect，so as to develop and utilize the resources of P.hydropiper more reasonably.Method:The volatile oil of P.hydropiper was extracted by steam distillation.The chemical constituents were isolated and identified by GC-MS，and the relative content of each component was determined by peak area normalization method.The antibacterial effect of volatile oil of P.hydropiper was detected by antibacterial test in vitro.Result:39 components were separated and identified from the volatile oil of P.hydropiper，which accounted for 82.31%of the total volatile oil.Antibacterial experiments in vitro showed that it has good antibacterial effect on various pathogenic bacteria.Conclusion:This experiment lays a theoretical foundation for further research on the essential oil of P.hydropiper，and provides a scientific basis for further exploitation and utilization of P.hydropiper.

Polygonum hydropiper；volatile oil；GC-MS；chemical constituents；antibacterial

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20171226

2017-08-07

國家自然科學基金項目（No.81073049）

王 悅（1992-），女，在讀碩士研究生，主要從事中藥炮制理論研究。

導師簡介：匡海學（1995-），男，教授，博士生導師，主要從事中藥性味理論及中藥藥效物質(zhì)基礎研究。