內(nèi)皮抑素對缺氧條件下脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成的作用

·實(shí)驗(yàn)研究·

內(nèi)皮抑素對缺氧條件下脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成的作用

謝坤鵬劉平王新杜軍輝

目的內(nèi)皮抑素是一種重要的血管生成抑制劑，本研究旨在研究內(nèi)皮抑素對缺氧條件下培養(yǎng)的猴脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A)增殖、遷移和管腔形成的作用。方法取生長狀況良好的RF/6A細(xì)胞用于用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞隨機(jī)分為缺氧組、缺氧+不同濃度重組人內(nèi)皮抑素組、對照組。培養(yǎng)24 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移，基質(zhì)膠法檢測管腔形成。結(jié)果缺氧24 h，細(xì)胞增殖活力、遷移和管腔形成均明顯增加，使用0.5～10 μg/ml重組人內(nèi)皮抑素預(yù)處理可明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成(P<0.05)。內(nèi)皮抑素的上述抑制作用均隨其濃度的升高而增強(qiáng)。結(jié)論內(nèi)皮抑素能夠明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的RF/6A細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，提示內(nèi)皮抑素對脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新生血管具有一定的抑制作用。

內(nèi)皮抑素；缺氧；新生血管；脈絡(luò)膜/視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞

血管生成(angiogenesis)是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及血管生成因子的分泌，蛋白水解酶的分泌和激活，細(xì)胞外基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞活化、遷移、增殖、生長、出芽和管腔形成，新的血管分化和成熟以及血管網(wǎng)的重塑[1]。在血管生成過程中起重要作用的刺激因子和抑制因子間發(fā)生失衡，就會(huì)導(dǎo)致新生血管的生長。眼部新生血管的形成可見于多種眼部疾病中，如脈絡(luò)膜新生血管(CNV)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)、視網(wǎng)膜中央/分支靜脈阻塞，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等(retinopathy of prematurity,ROP)，出血、滲出及增生等為其特點(diǎn)，導(dǎo)致眼的正常結(jié)構(gòu)破壞，嚴(yán)重危害視覺功能，極大影響患者生存質(zhì)量，且波及的年齡范圍較為廣泛。

尋找有效治療新生血管的藥物，是近年來眼科十分關(guān)注的領(lǐng)域。內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性新生血管抑制因子，相關(guān)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，它能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，可以減輕視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的新生血管生成，有望為新生血管性眼病患者帶來希望[2]。缺氧是病理性新生血管生成的重要誘因，本研究以猴視網(wǎng)膜/脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞(RF/6A細(xì)胞)為研究對象，觀察內(nèi)皮抑素對缺氧條件下細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的影響，以期為進(jìn)一步研究內(nèi)皮抑素在脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新生血管形成中的作用提供基礎(chǔ)。

資料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)儀器和藥品試劑

由中國科學(xué)院典型生化培養(yǎng)物保藏委員會(huì)附屬細(xì)胞庫儲(chǔ)備提供的RF/6A細(xì)胞系；由美國Gibco公司制備提供的EMEM型培養(yǎng)液；由中國杭州四季青生物工程材料有限公司生產(chǎn)提供的胎牛血清；由美國Sigma生物科技公司制備并提供的MTT試劑盒；由美國Sigma生物科技公司生產(chǎn)的基質(zhì)膠Matrigel；由中國南京先聲制藥有限公司生產(chǎn)的商品名為恩度的重組人內(nèi)皮抑制素；由日本Olympus公司制造的型號為 IX-50的倒置顯微鏡設(shè)備；由美國Bio-Rad公司制造的680型自動(dòng)酶標(biāo)儀設(shè)備。

二、主要技術(shù)處理方法

1. 細(xì)胞樣本培養(yǎng)處理和分組處理：將遵照臨床檢驗(yàn)操作技術(shù)規(guī)程采集獲取的RF/6A細(xì)胞，放置在溫度參數(shù)水平為37 ℃、包含有濃度為5%CO2氣體、以及濕度參數(shù)水平為95%的培養(yǎng)箱之中，在富含濃度比例為10%胎牛血清物質(zhì)的EMEM培養(yǎng)基的生化環(huán)境條件下運(yùn)用常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法進(jìn)行培養(yǎng)處置。在持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到3～4 d條件下，培養(yǎng)瓶瓶底呈現(xiàn)細(xì)胞鋪滿現(xiàn)象，遵照1：3的數(shù)值比例實(shí)施傳代處置。每天運(yùn)用顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并選取處在對數(shù)生長期，具備良好生長形態(tài)特征的細(xì)胞樣本開展后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程。將選作實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)樣本的細(xì)胞隨機(jī)劃分為對照組、缺氧組(其培養(yǎng)氣體環(huán)境物質(zhì)構(gòu)成結(jié)構(gòu)比例為1%O2，5%CO2，94% N2)、缺氧氣體培養(yǎng)環(huán)境結(jié)合差異化濃度的重組內(nèi)皮抑素組(在細(xì)胞接種培養(yǎng)基中分別加入濃度為0.5、1，以及10 μg/ml等濃度水平的重組內(nèi)皮抑素藥物完成預(yù)處理后，將其放置到厭氧培養(yǎng)箱中等候開展后續(xù)的培養(yǎng)處置技術(shù)過程)。

2. 檢驗(yàn)樣本細(xì)胞的增殖處置：選取和應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法針對檢驗(yàn)樣本細(xì)胞的增殖能力實(shí)施檢測處置。重點(diǎn)選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞作為檢驗(yàn)樣本，通過適當(dāng)實(shí)驗(yàn)處理方法丟棄上層清液，在運(yùn)用濃度水平為2.5 g/l的胰蛋白酶實(shí)施消化處置基礎(chǔ)上，向其中加入包含有10%胎牛血清物質(zhì)的DMEM培養(yǎng)液，繼而制備形成細(xì)胞濃度參數(shù)水平為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞培養(yǎng)懸液。抽取體積為200 μl的細(xì)胞培養(yǎng)懸液在96孔板中實(shí)施接種處置，在實(shí)施持續(xù)時(shí)間為24 h孵育處置條件下將原培養(yǎng)丟棄，并參照上文所述的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法將其等分為4組，并具體為每個(gè)實(shí)驗(yàn)分組結(jié)構(gòu)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。接續(xù)遵照不同分組的特征添加彼此成分不同的細(xì)胞培養(yǎng)液，隨即將細(xì)胞培養(yǎng)板放置在溫度參數(shù)為37 ℃、含有5%CO2氣體物質(zhì)，以及具備飽和濕度環(huán)境的生化培養(yǎng)箱中嚴(yán)格遵照相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)程實(shí)施培養(yǎng)處置。在持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到24 h條件，向培養(yǎng)板中的每個(gè)培養(yǎng)孔中添加濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，并放置在原有環(huán)境的培養(yǎng)箱中繼續(xù)實(shí)施持續(xù)時(shí)間為4 h的孵育處理，之后將各個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液物質(zhì)徹底丟棄，并接續(xù)向每個(gè)孔洞中接續(xù)添加體積為200 μl的DMSO培養(yǎng)液，在持續(xù)振蕩處置10 min條件下，要確保殘余的結(jié)晶物實(shí)現(xiàn)充分溶解狀態(tài)。并接續(xù)運(yùn)用由美國Bio-Rad公司制造和出售的680型自動(dòng)酶標(biāo)儀設(shè)備，在波長參數(shù)為570 nm的空間點(diǎn)位具體測定分析每個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)孔的吸光度參數(shù)值。針對每組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)樣本重復(fù)開3次檢驗(yàn)測定，確保實(shí)際測定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具備充分的準(zhǔn)確性。

3. 檢驗(yàn)樣本細(xì)胞的遷移處置：選取運(yùn)用細(xì)胞劃痕法針對檢驗(yàn)樣本細(xì)胞的遷移能力實(shí)施檢驗(yàn)處置。將RF/6A檢驗(yàn)樣本細(xì)胞遵照每個(gè)培養(yǎng)孔2×105個(gè)的細(xì)胞懸液濃度參數(shù)指標(biāo)水平在6孔板中實(shí)施接種實(shí)驗(yàn)技術(shù)處置，等候檢驗(yàn)樣本細(xì)胞的貼壁生長過程實(shí)現(xiàn)程度達(dá)到90%條件下，運(yùn)用移液槍尖技術(shù)構(gòu)件在細(xì)胞培養(yǎng)板之上以垂直空間方向劃一條直線，運(yùn)用PBS實(shí)驗(yàn)試劑連續(xù)實(shí)施3次輕度漂洗處理，徹底清除漂浮細(xì)胞群，繼而切實(shí)建構(gòu)形成無細(xì)胞的“裸區(qū)”。遵照上文論述的分組技術(shù)方法將待檢驗(yàn)細(xì)胞等分為4組，分別依次向4組待檢驗(yàn)細(xì)胞中加入適當(dāng)體積的所需培養(yǎng)液。針對每組待檢驗(yàn)細(xì)胞具體設(shè)定3個(gè)獨(dú)立平行孔，并基于倒置相差顯微鏡觀察檢驗(yàn)技術(shù)展開拍照記錄技術(shù)處理環(huán)節(jié)，并以此作為0 h時(shí)點(diǎn)的參考監(jiān)測點(diǎn)。在完成上述實(shí)驗(yàn)技術(shù)處理環(huán)節(jié)基礎(chǔ)上，將細(xì)胞培養(yǎng)板放置到溫度參數(shù)為37 ℃的培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)技術(shù)環(huán)境中開展持續(xù)時(shí)間為24 h的孵育處置，并在此基礎(chǔ)上再次實(shí)施照相檢查。運(yùn)用Photoshop圖像處理技術(shù)軟件具體開展后續(xù)的圖像分析處理，計(jì)算測定具體進(jìn)入無細(xì)胞“裸區(qū)”內(nèi)部待檢驗(yàn)細(xì)胞樣本的總體面積參數(shù)水平(像素參數(shù))[8]。上述檢驗(yàn)處置技術(shù)過程反復(fù)實(shí)施3次。

4. 細(xì)胞管腔形成技術(shù)處置過程：運(yùn)用Matrigel法實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法檢測確定待檢驗(yàn)細(xì)胞樣本的血管管腔結(jié)構(gòu)形成狀態(tài)。將Matrigel膠物質(zhì)放置在溫度參數(shù)水平為4 ℃環(huán)境條件下實(shí)施融化過夜處理，針對96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和槍頭技術(shù)組件實(shí)施預(yù)冷技術(shù)處置過程。在超凈實(shí)驗(yàn)操作工作臺(tái)環(huán)境中，選取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并每個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)孔中緩慢添加體積參數(shù)為80 μl液態(tài)的Matrigel膠物質(zhì)，在低速無菌離心技術(shù)處置條件下完全除去氣泡物質(zhì)。在37 ℃技術(shù)條件下開展持續(xù)時(shí)間介于30～60 min的孵育處置，并促使Matrigel膠實(shí)現(xiàn)凝固技術(shù)狀態(tài)；遵照上文敘述的分組實(shí)驗(yàn)處理法順次添加適當(dāng)劑量的，包含有濃度參數(shù)水平為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將RF/6A細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋處理濃度為2×105個(gè)/ml的細(xì)胞培養(yǎng)懸液，并在每組中添加50 μl。在實(shí)施持續(xù)時(shí)間為24 h的孵育處置條件下，運(yùn)用倒置相差顯微鏡設(shè)備時(shí)實(shí)施觀察檢驗(yàn)，隨機(jī)取5個(gè)血管管腔在放大200倍技術(shù)條件下實(shí)施視野照相處理，針對具體形成的完整管腔進(jìn)行計(jì)數(shù)處理，取平均計(jì)算值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 倒置相差顯微鏡下RF/6A細(xì)胞遷移(24 h)代表圖(①對照組，②缺氧組)圖2 倒置相差顯微鏡下RF/6A細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成代表圖(①對照組，②缺氧組)圖3 倒置相差顯微鏡下RF/6A細(xì)胞遷移代表圖(24 h)注：①缺氧組，②缺氧+0.5 μg/ml重組人內(nèi)皮抑素組，③缺氧+1 μg/ml重組人內(nèi)皮抑素組，④缺氧+10 μg/ml重組人內(nèi)皮抑素組圖4 倒置相差顯微鏡下RF/6A細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)形成代表圖 注：①缺氧組，②缺氧+0.5 μg/ml重組人內(nèi)皮抑素組，③缺氧+1 μg/ml重組人內(nèi)皮抑素組，④缺氧+10 μ g/ml重組人內(nèi)皮抑素組

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、缺氧對RF/6A細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成能力的影響

MTT結(jié)果顯示，缺氧條件培養(yǎng)24 h的RF/6A細(xì)胞增殖明顯強(qiáng)于對照組。兩組細(xì)胞吸光度值分別為：對照組(0.49±0.01)、缺氧組(0.78±0.05)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞劃痕法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞逐漸遷移入細(xì)胞劃痕區(qū)(圖1)，遷移面積(像素)為對照組(31753±1894)、缺氧組(47286±2310)，缺氧組的細(xì)胞遷移面積明顯大于對照組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧組細(xì)胞管腔形成能力明顯強(qiáng)于對照組(圖2)，兩組完整的管腔數(shù)分別為對照組(8.5±3.6)個(gè)、缺氧組(19.2±1.7)個(gè)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上提示缺氧對RF/6A細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成具有促進(jìn)作用。

二、重組人內(nèi)皮抑素對RF/6A細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成能力的影響

MTT結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h不同分組細(xì)胞的吸光度值分別為：缺氧組(0.78±0.05)、缺氧+0.5 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(0.57±0.02)、缺氧+1 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(0.38±0.02)、缺氧+10 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(0.16±0.07)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，四組間吸光度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相對于缺氧組，各濃度重組人內(nèi)皮抑素處理細(xì)胞的增殖能力下降，且隨著內(nèi)皮抑素濃度的增加而減弱。

細(xì)胞劃痕法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h不同分組RF/6A細(xì)胞的遷移面積(像素)分別為：缺氧組(47286±2310)、缺氧+0.5 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(30958±2490)、缺氧+1 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(27346±2335)、缺氧+10 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(12669±1143)。與缺氧組相比，各濃度重組人內(nèi)皮抑素處理細(xì)胞的遷移能力明顯降低，高濃度組細(xì)胞遷移面積明顯小于低濃度組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

Matrigel實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同分組RF/6A細(xì)胞形成的完整管腔數(shù)分別為：缺氧組(19.2±1.7)個(gè)、缺氧+0.5 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(12.4±3.1)個(gè)、缺氧+1 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(9.8±1.6)個(gè)、缺氧+10 μg/ml 重組人內(nèi)皮抑素組(5.6±1.1)個(gè)。與缺氧組相比，各濃度重組人內(nèi)皮抑素處理細(xì)胞的管腔能力明顯降低，高濃度組的管腔形成數(shù)目明顯小于低濃度組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，重組人內(nèi)皮抑素能夠明顯抑制RF/6A細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成能力，抑制血管生成過程，且其抑制能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)。

討 論

晚期視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管的形成是許多缺氧、缺血性視網(wǎng)膜病變和視神經(jīng)病變的共同病理改變和臨床表現(xiàn)，是患者致盲的主要原因，繼發(fā)的眼部病變，如玻璃體積血、增生性視網(wǎng)膜病變及視網(wǎng)膜脫離等均可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失[3，4]。新生血管的形成是一個(gè)多種因子參與其中的復(fù)雜過程，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等。目前，激光，抗新生血管藥物和玻璃體切除手術(shù)雖然對新生血管有一定的療效，可在一定程度上延緩病變的進(jìn)展，但均不可避免有損傷健康組織的風(fēng)險(xiǎn)，并且治療后容易復(fù)發(fā)，且少數(shù)患者有眼部不良反應(yīng)發(fā)生，故全世界尚未獲得完全安全和有效的治療方法。因此，探索視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管的病理機(jī)制和開發(fā)安全有效的治療方案已經(jīng)成為了眼科的重要研究方向。

RF/6A 以一種混合來源的脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞系，已經(jīng)被廣泛用于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新生血管的體外研究，包括CNV、ROP 和 DR等。近年來，RF/6A也被用于探索視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜新生血管的病理機(jī)制和可能的抑制劑[5-7]。因此，在本研究中我們采用RF/6A細(xì)胞研究內(nèi)皮抑素對視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜新生血管的作用。缺血缺氧是病理性新生血管形成的最主要的誘發(fā)因素，雖然CoCl2是最常用于模擬缺氧環(huán)境的化學(xué)制劑[8]，但是CoCl2誘導(dǎo)的缺氧效應(yīng)與實(shí)際的缺氧可能有所不同。鑒于此，本研究建立物理缺氧細(xì)胞模型，研究在不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的變化。研究證實(shí)，在物理缺氧條件下，RF/6A細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成均明顯強(qiáng)于常氧對照組，與采用CoCl2的化學(xué)缺氧條件取得了類似的結(jié)果[9]。

內(nèi)皮抑素是哈佛大學(xué)的O’Reilly等在1997年從小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤培養(yǎng)液中分離出來的一種新型蛋白質(zhì)，可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生。內(nèi)皮抑素的分子量約為20kD，對肝素具有較高的親和力，通過其肝素結(jié)合位點(diǎn)與血管生成因子競爭結(jié)合肝素，從而起到抑制血管生成的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮抑素是最有潛力的抗新生血管形成的物質(zhì)，可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯在G1期，涉及KDR/Flk-1、ERK、Bcl2/BclXL等多個(gè)信號通路，但其確切的機(jī)制尚未完全闡明[10，11]。內(nèi)皮抑素在人體內(nèi)廣泛分布，在眼部的組織中也有大量的表達(dá)，如結(jié)膜、角膜、虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜、淚液、房水和玻璃體液中，局部存在高濃度的內(nèi)皮抑素使一些眼組織能保持無血管狀態(tài)[12]。通過各種不同的給藥途徑行內(nèi)皮抑素及內(nèi)皮抑素基因治療(基因載體包括質(zhì)粒，脂質(zhì)體，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等)的研究證明，眼部新生血管的形成能有效的被內(nèi)皮抑素及內(nèi)皮抑素基因抑制[13-15]。

本研究采用的重組人內(nèi)皮抑素(恩度)是國內(nèi)合成的、國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于抗腫瘤的藥物。該藥比內(nèi)皮抑素更容易純化，顯示出穩(wěn)定的理化特性和更高的水溶性，具有更多的臨床優(yōu)勢[16]，鑒于其抗新生血管效應(yīng)，恩度已被用于治療多種癌癥，包括非小肺癌、乳腺癌和胃癌等。但是，將之用于眼部疾病領(lǐng)域的報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的重組人內(nèi)皮抑素能明顯抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，且這些抑制作用均隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)，結(jié)果與Lin等人的發(fā)現(xiàn)相似[17]，他們的研究發(fā)現(xiàn)，重組人內(nèi)皮抑素能通過下調(diào)HIF-1α和VEGF的表達(dá)抑制CoCl2誘導(dǎo)的RF/6A 細(xì)胞增殖和遷移。但化學(xué)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)與物理缺氧可能有所不同，本研究所得的結(jié)果可能更接近臨床真實(shí)情況。

綜上所述，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)內(nèi)皮抑素可抑制缺氧條件下RF/6A細(xì)胞的血管生成過程，但具體的分子機(jī)制值得深入研究。盡管RF/6A細(xì)胞作為脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜細(xì)胞系被廣泛用于脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新生血管的體外研究中，但脈絡(luò)膜與視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞屬于不同的細(xì)胞類型，常表現(xiàn)出較大的分子差異性，因此需要進(jìn)一步分別采用脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行研究。重組人內(nèi)皮抑素是高效的抗新生血管生成的物質(zhì)，其蛋白或基因在治療眼部新生血管方面具有較大的潛能，給新生血管性眼病患者帶來希望。但目前研究僅限于細(xì)胞和動(dòng)物模型中，將其應(yīng)用于人眼部治療還有待更多的研究。

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Effectsofendostatinoninvitroproliferation,migrationandtubeformationofchoroid-retinalendothelialcellsfollowinghypoxia

XieKunpeng,LiuPing,WangXin.

DepartmentofOphthalmology,ZhengzhouPeople'sHospital,Zhengzhou,Henan450003；DuJunhui.DepartmentofOphthalmology，Xi’anNinthHospital,Xi’an,Shanxi710054,China

ObjectiveEndostatin has been considered as one of the most potent angiogenesis inhibitors. This study aimed to investigate the effects of endostatin on in vitro proliferation, migration and tube formation of RF/6A choroidretinal endothelial cells.MethodsWell cultured RF/6A cells were randomly divided into three groups: the hypoxia group, the hypoixa group treated with varying concentrations of recombinant human endostatin and the control group. After 24 hours, cell proliferation, migration and tube formation was detected by MTT assay, wound scratch assay and seeding cells in matrigel, respectively.ResultsUnder hypoxia conditions, cell proliferation, migration and tube formation increased (P<0.05). Pretreatment with 0.510 μg/ml recombinant human endostatin significantly inhibited hypoxiainduced cell proliferation, migration and tube formation (P<0.05). In addition, the inhibitory effect of endostatin on RF/6A cells under hypoxia increases with the higher endostatin concentration.ConclusionsEndostatin can obviously inhibit cell proliferation, migration and tube formation of RF/6A cells. These effects indicate the inhibitory role of endostatin in choroidal and retinal angiogenesis.

Endostatin; Hypoxia; Neovascularization; Choroid-retinal endothelial cells

[JClinOphthalmol,2017,25:465]

10.3969/j.issn.1006-8422.2017.05.027

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(No.2016JM8018)

450003 鄭州市人民醫(yī)院眼科(謝坤鵬、劉平、王新)；710054 西安市第九醫(yī)院眼科(杜軍輝)

劉平(Email:lxylp2388@sina.com)

[臨床眼科雜志，2017，25：465]

(收稿：2017-03-20)