河南省豬源沙門氏菌的分離鑒定與血清分型

過效民

（河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008）

河南省豬源沙門氏菌的分離鑒定與血清分型

過效民

（河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008）

為了了解河南省豬源沙門氏菌的血清型分布，從鄭州、開封、焦作、許昌4個(gè)地市豬屠宰場抽取盲腸內(nèi)容物840批，通過對細(xì)菌的分離培養(yǎng)、純化，采用PCR和BD PhoenixTM-100全自動微生物鑒定系統(tǒng)對分離的沙門氏菌進(jìn)行鑒定，應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定。共分離沙門氏菌67株，分離率為8.0%，其中德爾卑沙門氏菌32株、鼠傷寒沙門氏菌31株，表明河南省豬源沙門氏菌以德爾卑沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為主。

沙門氏菌；分離；鑒定；血清分型

沙門氏菌是可導(dǎo)致人畜食物中毒和發(fā)病的重要病原菌，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界各類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒排在榜首[1]。人畜感染沙門氏菌后可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它能加重病態(tài)或死亡率，也能降低動物的生產(chǎn)繁殖能力。沙門氏菌的血清型眾多，目前已檢出的血清型多達(dá)2 600種，我國約有300種血清型37個(gè)血清組，雖然世界各國流行的沙門氏菌有所差異，但主要血清型都包括腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌等[2]。

該試驗(yàn)從河南省4個(gè)地市豬的屠宰場抽取盲腸內(nèi)容物樣品，進(jìn)行沙門氏菌分離、鑒定，隨后進(jìn)行血清分型，以期掌握河南省豬源沙門氏菌血清型分布情況，為河南省畜禽養(yǎng)殖業(yè)防控因沙門氏菌引起的疾病以及維護(hù)公共衛(wèi)生安全提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

2016年1月 至2016年12月抽取鄭州、開封、焦作、許昌4個(gè)地區(qū)規(guī)?；i屠宰場豬盲腸內(nèi)容物樣品840批，其中鄭州220批，開封200批，焦作220批，許昌200批。

1.1.2 菌株

鼠傷寒沙門氏菌質(zhì)控菌株ATCC14028（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

滅菌50 ml離心管、革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板，一次性無菌采樣棒（BHI），沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，swarm半固體瓊脂，營養(yǎng)瓊脂，沙門氏菌診斷血清，一次性接種棒，PCR預(yù)混酶。

1.1.4 儀器設(shè)備

低溫可疊放搖床，梯度PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.5 引物

沙門氏菌invA基因引物P1：5’-GTGAAATTATCGCC ACGTTCGGG-3’，P2：5’-CATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’，擴(kuò)增片段長度為284 bp。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)增菌

將使用一次性無菌采樣棒采集的豬盲腸內(nèi)容物樣品盡快送往實(shí)驗(yàn)室，36℃培養(yǎng)16～20 h，同時(shí)設(shè)陽性和陰性對照。

1.2.2 PCR初篩

采用菌液PCR，無菌吸取5 μl預(yù)增菌菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。

反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μl，ddH2O 18 μl，P1、P2各1 μl，模板5 μl。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min；4℃保存。同時(shí)設(shè)置陽性對照、陰性對照。

1.2.3 電泳

配制濃度為1.5%的瓊脂糖溶液，于微波爐中加熱溶解，待冷卻至50～60℃時(shí)，加入溴化乙錠（使其終濃度達(dá)到0.5 μg/ml）混勻，倒入已插上梳子的膠槽內(nèi)。待凝固后，轉(zhuǎn)入電泳槽中，在每個(gè)泳道中加入8 μl的PCR產(chǎn)物，160 V，電泳15～20 min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像。

1.2.4 樣品的分離、純化及鑒定

取PCR初篩陽性菌液1～2環(huán)，劃線于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)20～24 h，選取單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，采用藥敏試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.2.5 血清分型

先測Ο抗原，用無菌槍頭取營養(yǎng)瓊脂上經(jīng)鑒定的沙門氏菌與載玻片上加有10 μl沙門氏菌A-F群“Ο”多價(jià)診斷血清混勻，輕輕搖動玻片，于30 s內(nèi)讀取結(jié)果，凝集為陽性，渾濁或清亮為陰性，同時(shí)設(shè)無菌生理鹽水為對照。測完“Ο”多價(jià)后再測“Ο”單價(jià)。

測完Ο抗原后測H抗原，先測Ⅰ項(xiàng)，用一次性接種棒將營養(yǎng)瓊脂上沙門氏菌輕輕點(diǎn)接到swarm半固體瓊脂中央上，注意不要刺破瓊脂。用無菌槍頭取swarm半固體瓊脂上的菌落先進(jìn)行HMA、HMB、HMC、HMD多價(jià)測定，然后進(jìn)行單價(jià)測定；Ⅰ項(xiàng)測定完畢后，選出需要測Ⅱ項(xiàng)的，用一次性接種棒點(diǎn)接在加有相應(yīng)誘導(dǎo)劑的swarm半固體瓊脂上，然后按Ⅰ項(xiàng)方法進(jìn)行Ⅱ項(xiàng)的測定。

2 結(jié)果

2.1 樣品中沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

經(jīng)預(yù)增菌培養(yǎng)、PCR初篩及樣品的分離純化，最后經(jīng)藥敏試驗(yàn)鑒定，共分離沙門氏菌67株，分離率為8.0%，具體結(jié)果見表1。

表1 河南省豬屠宰場沙門氏菌分離情況

2.2 沙門氏菌血清分型結(jié)果

分離的67株沙門氏菌共分為5個(gè)型，分別為Derby（德爾卑）、Typhimurium（鼠傷寒）、Give（吉韋）、Reading（里定）、Tumodi（圖莫迪），其中德爾卑沙門氏菌32株，鼠傷寒沙門氏菌31株，吉韋沙門氏菌2株，里定沙門氏菌和圖莫迪沙門氏菌均為1株，具體結(jié)果見表2。

表2 河南省豬源沙門氏菌血清型分布

3 討論

近年來，沙門氏菌的污染在全世界范圍內(nèi)對食品安全問題產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。由沙門氏菌活菌導(dǎo)致的食物中毒屬于感染型中毒，主要是由于活菌進(jìn)入生物體腸道內(nèi)通過淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液引起全身感染，導(dǎo)致胃腸道的黏膜發(fā)炎引起腹瀉、體溫升高等癥狀[3]。在我國，由細(xì)菌污染導(dǎo)致的人食物中毒中70%以上是由沙門氏菌引起的，引起沙門氏菌中毒的食物中，畜產(chǎn)品占90%[4]。動物源性食品中重要的致病菌出現(xiàn)主要來自動物養(yǎng)殖期間的感染和屠宰加工過程中的污染兩個(gè)方面。因此，對屠宰場沙門氏菌的檢測及血清分型對公共衛(wèi)生以及產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)有著十分重要的意義。

通過對河南省屠宰場抽取豬盲腸內(nèi)容物樣品進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定，共分離沙門氏菌67株，分離率為8.0%，其中焦作、鄭州、開封、許昌的分離率分別為12.7%（28/220）、9.1%（20/220）、6.5%（13/200）和 3.0%（6/200）。這一結(jié)果與狄文婷等[5]所研究的大連新鮮豬肉中沙門氏菌的分離率17.6%相比較低，與岳秀英等[6]所研究的四川養(yǎng)豬場豬肛拭子樣品中沙門氏菌的分離率5.68%相比稍高，表明不同地區(qū)、不同采樣部位中沙門氏菌分離率存在差異。

通過對67株沙門氏菌進(jìn)行血清型鑒定，共有德爾卑沙門氏菌32株，鼠傷寒沙門氏菌31株，吉韋沙門氏菌2株，里定沙門氏菌和圖莫迪沙門氏菌均為1株。其中鄭州、開封、許昌均為德爾卑沙門氏菌最多，其次為鼠傷寒沙門氏菌；焦作鼠傷寒沙門氏菌最多，其次為德爾卑沙門氏菌。這一結(jié)果與陳玲等[7]人在對南方食品中沙門氏菌污染情況的調(diào)查一致。而與Wang[8]等在對安徽雞屠宰場的調(diào)查發(fā)現(xiàn)中，印第安納沙門氏菌和嬰兒沙門氏菌是主要的兩種血清型的結(jié)果不一致。表明因地域、環(huán)境和用藥情況不同，不同樣品來源、不同地區(qū)或同一地區(qū)不同時(shí)間沙門氏菌的流行優(yōu)勢菌株有所不同。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，河南省不同地區(qū)的豬屠宰場沙門氏菌的污染情況存在差異，血清型種類也各異，這是由于各地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境、氣候條件、用藥情況及屠宰場的衛(wèi)生情況不同所致。以后應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范養(yǎng)殖場合理用藥，改善屠宰場環(huán)境衛(wèi)生，防止屠宰過程中沙門氏菌交叉污染，從動物性食品的源頭控制沙門氏菌的污染，保證食品衛(wèi)生安全。

[1]王士平.沙門氏菌食物中毒急救及防控措施[J].臨床合理用藥雜志，2012，5（8）：9-10.

[2]徐桂云，樊世杰.家禽沙門氏菌感染現(xiàn)狀及不同國家的防治策略[J].中國家禽，2012，34（9）：7-12.

[3]王潤蠢.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測肉中沙門氏菌的研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[4]王娟，王君瑋，曲志娜，等.畜禽產(chǎn)品中致病菌污染的危害、現(xiàn)狀與對策[J].中國動物檢疫，2013，30（12）：24-28.

[5]狄文婷，杜雄偉，吳靜，等.豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：278-280.

[6]岳秀英，葛榮，汪開毓，等.四川省豬源沙門氏菌及耐藥性變遷調(diào)查[J].四川動物，2015，（5）：707-713.

[7]陳玲，張菊梅，楊小鵑，等.南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型[J].微生物學(xué)報(bào)，2013，（12）：1326-1333.

[8]Wang H，Ye K，Wei X，et al.Occurrence，antimicrobial resistance and biofilm formation of Salmonella isolates from a chicken slaughter plant in China[J].Food Control，2013，33（2）：378-384.

S852.61

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1004-5090（2017）10-0006-02

2017-08-15）