櫻桃果實酶促褐變及其影響因素的研究

方 瑩，李雨念，王梅志，李佳冰，鐘藝萃，王海英

(中南民族大學 生命科學學院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護與綜合利用工程中心，武漢 430074)

櫻桃果實酶促褐變及其影響因素的研究

方 瑩，李雨念，王梅志，李佳冰，鐘藝萃，王海英

(中南民族大學 生命科學學院，南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護與綜合利用工程中心，武漢 430074)

以紅燈品種的櫻桃果實為材料，對果實中的多酚氧化酶(PPO)的酶學特性進行了研究.通過其與鄰苯二酚反應后產(chǎn)物的吸光度值的測量，分別研究了櫻桃在不同儲存條件下褐變度的變化，以及溫度、pH值、反應時間和氧化抑制劑L-半胱氨酸、抗壞血酸、檸檬酸和肉桂酸等對PPO活性的影響. 結(jié)果表明：以0.01mol/L的鄰苯二酚作為底物，櫻桃果肉PPO分別在反應溫度為10 ℃和pH值為4.0時的活性較高，反應時間為10～15 min時活性較高，褐變程度較強.在一定的條件下，幾種抑制劑對櫻桃果肉的PPO活性呈現(xiàn)出不同的抑制效果，以抗壞血酸的抑制效果為最佳.

櫻桃；酶促褐變；多酚氧化酶；抑制劑

櫻桃是某些李屬類植物的統(tǒng)稱，包括櫻桃亞屬、酸櫻桃亞屬、桂櫻亞屬等.果實外表色澤鮮艷、晶瑩美麗、紅如瑪瑙、黃如凝脂，果實富含糖、蛋白質(zhì)、維生素及鈣、鐵、磷、鉀等多種元素.櫻桃一般于四五月成熟，由于采收期正值高溫季節(jié)，采摘后貯藏過程中果實容易失水皺縮、掉梗、褐變和腐爛，品質(zhì)極易敗壞，市場供應期甚短.許多研究表明，果實中的多酚氧化酶(PPO)是果實發(fā)生酶促褐變，導致果實腐敗變質(zhì)的主要物質(zhì)，并且對水果加工產(chǎn)品如果汁、果酒等飲料的色澤、品質(zhì)和風味有很大影響[1，2].

PPO是一類含銅的氧化還原酶，可以用一元酚和二元酚作底物.在有氧的條件下，PPO將鄰位的酚氧化為醌，醌很快聚合成為褐色素而引起組織褐變[3-8].PPO的活性受溫度、pH值、底物濃度及作用時間等諸多因素影響，并且不同植物組織中各種因素的影響也各有不同. 對櫻桃酶促褐變機理的研究主要體現(xiàn)在對櫻桃果實中多酚氧化酶的活性研究以及找出抑制其活性的有效方法，本研究對櫻桃果實的保鮮、貯藏、運輸以及副產(chǎn)品的生產(chǎn)加工有重要的理論價值及實際參考意義.

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮無損的櫻桃果實購自武漢農(nóng)貿(mào)市場.鄰苯二酚、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、L-半胱氨酸、肉桂酸、抗壞血酸、檸檬酸等(國藥集團化學試劑有限公司)均為分析純或化學純.

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度計(UV-6100PC型，上海美譜達儀器有限公司)，電子天平(FA2004型,上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，高速冷凍離心機(HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(HH-S型，常州翔天實驗儀器廠)，pH計(FE20型，梅特勒-托利多儀器有限公司).

1.2 PPO的提取

櫻桃洗凈去核后，按1∶1(w/v)比例加入預冷的0.05 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液，低溫搗碎至勻漿，然后將勻漿液于6000 r/min下冷凍離心15 min，上清液即為酶的粗提液，低溫保存?zhèn)溆?

1.3 褐變度的測定

采用消光值法[9]測定.櫻桃果肉樣品10 g與冷卻蒸餾水按1∶10(w/w)混合并勻漿30 s后冷凍離心(6000 r/min，5 min)，取上清液于室溫和4 ℃條件下貯藏.0、2、4、6、8、10 d后取上清液部分于25 ℃保溫5 min，在410 nm測定其吸光度值，結(jié)果以A410表示褐變度.

1.4 不同影響因素對櫻桃果肉PPO活性的影響

1.4.1 溫度對PPO活性的影響

反應體系包括0.05 mol/L pH 6.5的緩沖液3 mL，鄰苯二酚1 mL，粗酶液1 mL，該體系分別在10、20、25、30、40、50 ℃條件下反應10 min，然后加入1 mL三氯乙酸終止反應，測定其吸光度值.以吸光度值為縱坐標，溫度為橫坐標，繪制曲線，以確定櫻桃果肉中PPO活性測定的最佳反應溫度.

1.4.2 pH值對PPO活性的影響

配制不同緩沖液，使反應體系的pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0.反應體系包括緩沖液3 mL，粗酶液1 mL，鄰苯二酚1 mL.25 ℃保溫5 min，反應后加入1 mL三氯乙酸終止反應，于410 nm處測定其吸光度值.

1.4.3 反應時間對PPO活性的影響

按上述取樣，反應體系在25 ℃恒溫水浴中分別反應5、10、15、20、30、40 min后測定吸光度值.作圖以確定櫻桃PPO活性測定的最佳反應時間.

1.4.4 抑制劑對PPO活性的影響

吸取粗酶液1 mL，分別加入1 mL濃度為0.1%的L-半胱氨酸、肉桂酸、檸檬酸、抗壞血酸，室溫下振蕩混勻，再加入2 mL磷酸鹽緩沖液，1 mL 0.01 mol/L鄰苯二酚，于25 ℃水浴中反應10 min，然后加入1 mL三氯乙酸終止反應，測定其吸光度值.比較相同濃度下各抑制劑對櫻桃果肉PPO活性的影響[10].對照組中抑制劑的量由緩沖液替代之，其他做相同處理.

1.4.5 抗壞血酸濃度對PPO活性的影響

吸取粗酶液1 mL，分別加入1 mL濃度為0.0250%、0.0375%、0.0500%、0.1000%、0.2000%、0.3000%的抗壞血酸，室溫振蕩混勻.再加入2 mL磷酸鹽緩沖液，1 mL 0.01 mol/L鄰苯二酚，于25 ℃水浴中反應10 min，然后加入1 mL三氯乙酸終止反應，測定其吸光度值.比較不同濃度的抗壞血酸對櫻桃果肉PPO活性的抑制作用.

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃果實于貯藏期間褐變度(BD)的變化

櫻桃果肉在室溫和4 ℃貯藏條件下，BD均呈穩(wěn)定上升趨勢(圖1)，表明切分可導致褐變現(xiàn)象的迅速發(fā)生，并且隨著時間增長，褐變反應會持續(xù)進行[11，12].相比而言，室溫貯藏條件下櫻桃樣品的褐變程度顯著高于4 ℃貯藏條件下的櫻桃樣品，這說明低溫保存對櫻桃酶促褐變有較明顯的抑制效果.此外，室溫下貯藏的櫻桃樣品4 d之前快速褐變，8 d之后進入平臺期.這可能是因為櫻桃自身的底物濃度有限，即多酚類物質(zhì)隨時間消耗減少而使褐變反應進程減緩.

圖1 室溫和4 ℃下櫻桃果實褐變情況Fig.1 The change of browning degree in cherry fruits at room temperature and 4 ℃

2.2 溫度對櫻桃果肉PPO活性的影響

從圖2可知，櫻桃果實PPO在10 ℃呈現(xiàn)最大的PPO活性，隨著溫度的上升，PPO活性總體呈下降趨勢，但于20～25 ℃溫度范圍內(nèi)維持在較穩(wěn)定的水平，超過25 ℃以上時櫻桃果肉PPO活性呈明顯下降趨勢，這同許多果蔬的PPO的最適溫度為25～45 ℃之間的結(jié)果有所不同，如火龍果和蓮藕中PPO的活力分別在30 ℃和35 ℃時達到最高值，鮮切山藥中PPO的活力則在45 ℃時達到最高[3，9,11].這說明鮮切櫻桃果肉中的PPO活力對溫度的敏感性與其他果蔬的PPO之間存在一定的差異，耐熱性較差，其具體機理仍有待進一步的探究.

圖2 溫度對櫻桃PPO活性的影響Fig.2 The effect of temperature on activity of cherry PPO

2.3 pH值對櫻桃果肉PPO活性的影響

隨著體系酸度的降低，櫻桃果肉PPO活性最初有微弱的增大趨勢(圖3)，在pH值為4.0時有一個吸收峰，而當繼續(xù)增大反應的pH值時，櫻桃果肉PPO活性明顯下降，于pH 5.0～7.0范圍內(nèi)下降變化率最大；pH在8.0之后進入穩(wěn)定期.該結(jié)果表明，櫻桃果肉PPO的活性對pH值的變化較為敏感，且其最適pH值為4.0.

圖3 pH值對PPO活性的影響Fig.3 The effect of pH value on activity of PPO

2.4 反應時間對櫻桃果肉PPO活性的影響

由圖4可以看出，隨著反應時間的延長，吸光度值呈上升趨勢，這表明櫻桃果肉的酶促褐變反應在該時間段內(nèi)在持續(xù)進行，醌類物質(zhì)產(chǎn)生使得褐變度增加.相比而言，反應時間在15 min之前褐變增長速度較快，約20 min之后增長速度減慢.可能原因一方面是櫻桃PPO活性隨著時間的延長而變?nèi)?，另一方面是底物濃度隨反應時間的延長而逐漸降低.

圖4 反應時間對PPO活性的影響Fig.4 The effect of reaction time on PPO activity

2.5 抑制劑對櫻桃果肉PPO活性的影響

相同濃度的抗壞血酸、肉桂酸、L-半胱氨酸、檸檬酸對櫻桃PPO活性均有一定的抑制作用(圖5)(p<0.05)，且抗壞血酸與L-半胱氨酸的抑制作用較強，肉桂酸與檸檬酸的抑制作用較弱.抗壞血酸與L-半胱氨酸具有顯著性差異(p<0.05).因此，可以初步判斷幾種抑制劑對櫻桃PPO活性的抑制效果依次為：抗壞血酸>L-半胱氨酸>肉桂酸>檸檬酸.該結(jié)果與文獻報道的結(jié)果存在一定差異，推測不同水果的PPO存在一定的種屬特異性.

圖5 不同抑制劑對PPO活性的影響Fig.5 The effects of different inhibitors on the activity of PPO

2.6 抗壞血酸濃度對PPO活性的影響

抗壞血酸對櫻桃PPO活性的抑制作用最佳，進一步研究不同濃度的抗壞血酸對櫻桃PPO活性的影響情況.圖6的結(jié)果表明，濃度為0.1%的抗壞血酸抑制效果最佳，此后若繼續(xù)增加濃度，抑制效果在濃度為0.2%時略有減弱，在濃度為0.3%時抑制效果又有一定增強.從食品安全和經(jīng)濟成本的角度出發(fā)，添加劑用量也不宜過多.因此，抗壞血酸的添加量以濃度為0.1%為宜.

圖6 抗壞血酸濃度對PPO活性的影響Fig.6 The effect of ascorbic acid concentration on the activity of PPO

3 結(jié)語

多酚氧化酶(PPO)一直被公認為是引起鮮切果蔬酶促褐變的主要酶類[13].由于不同果蔬中多酚氧化酶的酶學特性及其底物各不相同，不同種類或品種的果蔬中PPO的活性及其反應條件存在一定的品種特異性[14].

本實驗發(fā)現(xiàn)，櫻桃果肉在4 ℃時褐變度明顯低于室溫，且褐變不明顯. 當溫度上升到10 ℃時，PPO活性顯著增加，在10～25 ℃之間維持在較高水平，此后逐漸降低，說明櫻桃果肉PPO的耐熱性較差.此外，櫻桃PPO在pH為3.0～5.0時活性較高， pH值4.0時達到峰值， pH值大于8.0時PPO活性抑制效果明顯.反應時間在10～15 min時褐變快速發(fā)生，隨著反應時間的增加，吸光值也逐漸增加.4種抑制劑對櫻桃PPO均有不同程度的抑制作用，以抗壞血酸的抑制效果最佳.因此，在櫻桃果醬、果酒、果干、果汁等副產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)中，可采用瞬時高溫、適當調(diào)節(jié)pH值、控制反應時間以及適度添加濃度適宜的抗壞血酸等方法，合理降低櫻桃果肉中多酚氧化酶的活性從而控制其褐變度，進而提高商品的經(jīng)濟價值和營養(yǎng)價值.

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StudyontheEnzymaticBrowninginCherry

FangYing,LiYunian,WangMeizhi,LiJiabing,ZhongYicui,WangHaiying

(Engineering Research Center for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area of Southern China, College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

The enzymatic characteristics of Hongdeng cherry polyphenol oxidase(PPO)was preliminary studied by spectrophotometer using catechol as substrate. The change of browning degree in cherry fruits at room temperature and 4 ℃ and the effects of the pH, reactivity time, temperature and inhibitors such as L-cysteine, Vic, citric acide and 4-hydroxycinnamic acid were studied. The results showed that the optimum conditions as follow: pH is 4.0, the reaction temperature is 10 ℃,the time of reaction was 10～15 min.Under certain conditions, four kinds of inhibitors presents different inhibiting effect, and the optimum one is Vic.

cherry；enzymatic browning；polyphenol oxidase；inhibitor

2017-06-30

方 瑩(1987-)，女，講師，博士，研究方向：食品科學技術，E-mail：fangying19870808@163.com

湖北省自然科學基金資金(2015CFB519);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項目(CZQ14016); 湖北省戰(zhàn)略性新興(支柱)產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)計劃(GJZ15001)

Q945.6+6

A

1672-4321(2017)04-0060-04