纖細席藻對重金屬鎳脅迫的響應研究

陳蘭洲，汪 靜，武艷芳，柯 檀，梁亞楠，劉思瑤

(1 武漢大學 資源與環(huán)境科學學院，湖北省環(huán)境修復技術研究中心，武漢430072；2武漢文科生態(tài)環(huán)境有限公司，武漢 430000)

纖細席藻對重金屬鎳脅迫的響應研究

陳蘭洲1，汪 靜1，武艷芳2，柯 檀1，梁亞楠2，劉思瑤1

(1 武漢大學 資源與環(huán)境科學學院，湖北省環(huán)境修復技術研究中心，武漢430072；2武漢文科生態(tài)環(huán)境有限公司，武漢 430000)

實驗研究了纖細席藻Phormidiumtenue對重金屬鎳脅迫的光合生理響應及外源抗氧化劑的保護作用， 結果發(fā)現(xiàn):在不同濃度Ni2+短期處理纖細席藻時，其熒光產(chǎn)量隨處理時間先發(fā)生急劇下降，隨后有所回升；熒光產(chǎn)量隨著Ni2+濃度的增加而明顯降低，在100 mg/L Ni2+濃度下熒光曲線的O、J、I、P相完全消失，光合活性(Fv/Fm)喪失. 經(jīng)抗氧化劑抗壞血酸(ASC)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)分別預處理的纖細席藻熒光產(chǎn)量有一定程度恢復，且ASC抗氧化作用相比NAC更加明顯，但其保護作用均隨著時間增加而逐漸減弱. 在不同濃度的Ni2+長期脅迫時，1 d內(nèi)抑制作用顯著，葉綠素a、光合活性及電子傳遞鏈光合參數(shù)(ET0/ABS、ET0/TR0、RC/CS0)下降顯著，SOD活性升高. 實驗結果表明：鎳對纖細席藻的光合生理活性具有較強的抑制作用，而外源抗氧化劑可以短期內(nèi)有效緩解重金屬鎳脅迫造成的損傷，因此在吸附去除重金屬時可有效提高藻類的吸附效率和循環(huán)利用.

纖細席藻；鎳；葉綠素熒光動態(tài)；抗氧化系統(tǒng)

鎳是生物體的必需微量元素，可增加脲酶活性，調節(jié)氮代謝，刺激氮素和鉀素積累，刺激植物生長. 缺Ni2+時會造成小球藻生長受阻，細胞缺綠，生物量減少[1]. 鎳在自然界中以化合物的形式廣泛存在，隨著采礦、冶煉、電鍍等工業(yè)的發(fā)展，大量鎳進入到環(huán)境當中，引起水體、土壤及大氣重金屬污染. 重金屬通過食物鏈發(fā)生生物富集，破壞生物體的正常生理代謝和功能甚至造成死亡. 通過各種途徑進入水體的重金屬首先會影響藻類生物，藻類對環(huán)境變化具有指示作用[2]. 當鎳離子濃度≤2 mg/L小球藻和柵藻生長正常，而當鎳濃度達到10 mg/L時，藻類生長幾乎停止[3].

纖細席藻是光合自養(yǎng)型絲狀藍藻，藻絲發(fā)達，胞外多糖豐富，藻多糖為負電荷的多聚大分子，含有羧基、羥基、巰基等多種功能團，為重金屬提供了大量的吸附位點，因此可以用泌糖藍藻來吸附污水中的重金屬[4]. 研究纖細席藻對重金屬鎳脅迫的響應機制，是研究纖細席藻吸附去除重金屬作用機制的生理基礎，能夠進一步完善纖細席藻作為新型生物吸附劑在重金屬環(huán)境治理上的應用.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

纖細席藻分離于寧夏沙坡頭，經(jīng)分離、純化，保種于淡水培養(yǎng)物保藏中心(FACHB). 培養(yǎng)物于無菌操作臺勻漿后接種到滅菌冷卻至室溫的BG-11培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱光強50 μE/(m2·s)，25±1 ℃，24 h 持續(xù)光照，通氣培養(yǎng)至對數(shù)期.

1.2 實驗方法

將培養(yǎng)至生長對數(shù)期的纖細席藻轉移至已滅菌的250 mL錐形瓶中，加入Ni2+儲備液，使藻液中Ni2+最終濃度為0、5、10、20、50、100 mg/L. 在10、30、60、120、240、480 min測定纖細席藻的熒光參數(shù). 同時在0、24、48、72 h時測定纖細席藻的葉綠素a含量、MDA含量、SOD活性以及熒光參數(shù).

將培養(yǎng)至生長對數(shù)期的纖細席藻轉移至已滅菌的250 mL錐形瓶中，分別加入ASC和NAC兩種抗氧化劑使其終濃度為0.5 mol/L，預處理2 h后加入Ni2+儲備液，終濃度為50 mg/L，在10、30、60、120、240、480 min測定纖細席藻的熒光參數(shù).

1.2.1 熒光參數(shù)測定

取經(jīng)不同濃度Ni2+處理后的纖細席藻藻液2 mL，置于暗盒中暗適應15 min后采用便攜式植物效率分析儀(PEA，HanasatechR，UK)于室溫下測定，激發(fā)光強為最大光強的50%(約1500 μE/(m2·s))，記錄時間為5 s. 經(jīng)處理后可獲得葉綠素熒光誘導動力學曲線(O-JI-P)及其他熒光參數(shù)[5].

1.2.2 葉綠素a含量測定

取5 mL藻液，冷凍離心機離心(8000 r/min，10 min)，棄上清液，收集藻體，加入5 mL 95 %乙醇，置4 ℃冰箱抽提浸取24 h，中間搖蕩2～3 次以使葉綠素a充分溶出. 離心(8000 r/min，10 min)取上清液，分光光度計測定吸光度值D665和D649，經(jīng)計算得葉綠素a含量[6].

1.2.3 丙二醛(MDA)含量測定

丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法：取新鮮藻液5 mL，離心后倒去上清液，收集藻體，加入2 mL 10 %三氯乙酸(TCA)，2 mL 0.6 %硫代巴比妥酸(TBA)(用堿溶液助溶，10 % TCA定容)，混合均勻，100 ℃水浴20 min，冷卻至室溫后離心(8000 r/min，10 min)，取上清液用紫外可見分光光度計分別測定其在450、532和600 nm處的吸光度，計算MDA含量[7].

1.2.4 SOD酶活性測定

SOD酶活性采用氮藍四唑法：取新鮮藻液5 mL，離心(8000 r/min，10 min)，收集藻體分別用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.8)洗滌藻細胞3次，加入5 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.8)，冰浴超聲破碎，低溫離心，上清液即為粗酶提取液.加入粗酶液1.0 mL，分別加入3.1 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，含100 μmol/L EDTANa2)，0.3 mL甲硫氨酸溶液(220 mmol/L)，0.3 mL氯化硝基四氮唑藍溶液(1.25 mmol/L)，0.3 mL核黃素溶液(33 μmol/L). 混勻后，將一只對照管置于暗處，另取兩支對照管和待測樣品置于4000 Lux日光燈下反應20 min，反應結束后用黑布罩遮蓋試管終止反應，具體計算方法見文獻[8].

2 結果與討論

2.1 Ni2+短期脅迫對纖細席藻葉綠素熒光動力曲線的影響

經(jīng)過Ni2+處理后，纖細席藻的葉綠素熒光強度和熒光各相均發(fā)生了明顯的變化(圖1). 當體系中Ni2+濃度為50 mg/L時，隨著脅迫時間的增加，纖細席藻的熒光動力曲線呈現(xiàn)出熒光強度及J、I、P各相先下降后有所恢復的趨勢，在處理10 min時下降到最低，隨后熒光動力學曲線出現(xiàn)一定程度的恢復. 在480 min時熒光強度較空白對照組降低，曲線形狀良好，J、I、P各相均明顯存在，表明電子傳遞鏈受阻并未中斷. 由圖1B可以看出，當不同濃度的Ni2+處理2 h后纖細席藻的葉綠素熒光誘導動力學曲線出現(xiàn)不同程度的變化. 5 mg/L Ni2+與20 mg/L處理下相對空白對照組的熒光強度幾乎沒有變化，P相稍有下降；10 mg/L時，其熒光可變強度和各相均出現(xiàn)上升；20 mg/L以上處理時，纖細席藻的熒光可變強度出現(xiàn)明顯下降，J、I、P相均下降甚至完全消失，完全失去光合活性，電子傳遞鏈受阻嚴重而中斷.

(A)50 mg/L Ni2+脅迫纖細席藻；(B)不同濃度Ni2+處理纖細席藻2 h圖1 Ni2+對纖細席藻葉綠素熒光誘導動力學曲線的影響Fig.1 Effect of Ni2+ stress on the chlorophyll a fluorescence transients of Phormidium tenue

2.2 Ni2+短期脅迫下抗氧化劑對纖細席藻葉綠素熒光動力學曲線及光合活性(Fv/Fm)的影響

由圖2可以看出，兩種抗氧化劑預處理過的纖細席藻相對未處理過的，葉綠素熒光誘導動力曲線可變強度增大，J、I及P相熒光值均升高，但仍然低于空白對照組，表明Ni2+破壞了QA→QB傳遞過程，但抗氧化劑能夠在一程度上減輕重金屬對纖細席藻的脅迫影響，使電子傳遞不中斷，光合系統(tǒng)PS Ⅱ能夠正常進行光量子傳遞.Fv/Fm代表的是PS II的最大光化學量子產(chǎn)量,它的高低直接反映了PS II反應中心的光能轉換效率，也稱為最大PS II的光能轉換效率. 圖2B顯示抗氧化劑預處理組的Fv/Fm值明顯高于未處理組，甚至略高于空白對照組，而在240 min后發(fā)生明顯下降，這可能是因為抗氧化劑的保護作用具有一定的時效性，隨著時間的延長可能發(fā)生代謝分解.

(A) 葉綠素熒光誘導動力學曲線；(B)Fv/Fm圖2 兩種抗氧化劑對50 mg/LNi2+處理下纖細席藻葉綠素熒光誘導動力學曲線及Fv/Fm的影響Fig.2 Effects of two antioxidants treatment on the chlorophyll a fluorescence transients and Fv/Fm of Phormidium tenue stressed by 50 mg/L Ni2+

ET0/ABS代表反應中心吸收光能用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，在Ni2+脅迫下纖細席藻用于電子傳遞的量子減少，抗氧化劑預處理過的纖細席藻即便受到相同濃度Ni2+的脅迫，其用于電子傳遞的量子增加明顯，甚至高于空白對照組(表1). 50 mg/L Ni2+脅迫下纖細席藻ET0/TR0活性反應中心開放程度降低，而抗氧化劑預處理過的藻細胞活性反應中心開放有明顯恢復.抗氧化劑預處理過的纖細席藻RC/CS0(單位面積內(nèi)反應中心數(shù)量)較未處理過的增加18%左右，對比空白對照組卻有所減少. 因此ASC和NAC均對纖細席藻的光合系統(tǒng)發(fā)揮了保護作用，緩解了逆境脅迫下藻細胞的氧化損傷.

表1 抗氧化劑對Ni2+短期脅迫纖細席藻光合性能指數(shù)的影響Tab.1 Effects of Ni2+ on the photosynthetic parameters of Phormidium tenue

注：a、b、c、d、e表示使用單因素方差分析中在p<0.05的置信區(qū)間內(nèi)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性

2.3 Ni2+長期對脅迫纖細席藻后葉綠素熒光動力曲線及Fv/Fm的變化

隨脅迫時間的增加，Ni2+對纖細席藻光合效應的影響顯著(圖3). 5 mg/L Ni2+處理1 d后，纖細席藻的熒光強度降低不明顯，J、P相發(fā)生下降. 5 mg/L及以上濃度處理時，可變強度逐漸降低，O、J、I、P各相下降. 100 mg/L Ni2+處理纖細席藻1 d時，葉綠素熒光誘導動力學曲線強度降到最低點，各相完全消失，表明積累的QA-完全被氧化，反應中心無法再接受光量子而失活. 隨著時間的增加，各濃度處理組下QA→QB電子傳遞鏈受損程度加劇，在3 d時，高濃度(>50 mg/L)處理組的熒光強度明顯下降，各相強度顯著降低甚至消失. 圖3D顯示的是Ni2+長期脅迫下纖細席藻最大光化學效率(Fv/Fm)的變化.隨著時間的延長和濃度的增加，F(xiàn)v/Fm顯著降低. 在1 d時，各處理組的Fv/Fm明顯低于空白對照組(p<0.05)，在3 d后Fv/Fm極顯著降低(p<0.01). 100 mg/L處理組在1 d時Fv/Fm已下降到最低，光合系統(tǒng)失活.

A)1d；B)2d；C)3d；D)Fv/Fm圖3 Ni2+長期脅迫下纖細席藻葉綠素熒光誘導動力學曲線及Fv/Fm的變化Fig.3 Effects of Ni2+ stress on the chlorophyll a fluorescence transients and Fv/Fm of Phormidium tenue

外源加入不同濃度的Ni2+處理3 d后，纖細席藻的PS Ⅱ反應中心電子傳遞鏈受阻，反應活性降低(表2). 隨著重金屬濃度的增加及處理時間的延長，反應中心吸收光能用于電子傳遞的量子逐漸減少，具活性反應中心的開放程度和單位面積內(nèi)反應中心的數(shù)量均持續(xù)降低，100 mg/L處理組的反應中心完全關閉，纖細席藻完全喪失光合活性.

表2 不同濃度Ni2+脅迫下纖細席藻光合性能指數(shù)的變化Tab.2 Effects of Ni2+ on photosynthetic parameters of Phormidium tenue

注：a、b、c、d、e表示使用單因素方差分析中在p<0.05的置信區(qū)間內(nèi)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性

2.3 Ni2+長期脅迫下纖細席藻葉綠素a、SOD、MDA含量的變化

在加入Ni2+后，隨處理時間的延長和Ni2+濃度的增加，纖細席藻的葉綠素a含量逐漸降低(圖4A). 5 mg/L Ni2+處理3 d后，纖細席藻的葉綠素a含量相對對照組并未發(fā)生顯著下降. 10～100 mg/L處理組的葉綠素a在1 d后即發(fā)生明顯下降，3 d后相對同期對照組下降10.67%、20.07%、25.28%、50.74%.

圖4B顯示了Ni2+長期脅迫下纖細席藻MDA含量的變化. 在加入Ni2+后，隨著時間的增加，藻體MDA含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢，隨著Ni2+濃度的升高，其MDA含量出現(xiàn)相比同期對照組先上升再下降的趨勢，但總體并未增加. 5、10、20、50 mg/L處理組在1 d時相對同期對照組MDA含量降低12.47%、19.88%、5.62%、4.49%，而最高濃度100 mg/L處理下纖細席藻MDA含量低于對照組39.07%，此后3 d均無明顯變化，藻細胞已經(jīng)失去活性.

由圖4C可以看出，隨著處理時間的延長和Ni2+濃度的增加，纖細席藻SOD活性呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢. 在處理1 d后，低濃度(<100 mg/L)處理組的SOD活性相對對照組分別上升了43.32%、37.78%、35.80%、21.53%，而100 mg/L處理組的SOD活性在1、2、3 d脅迫下均低于同期對照組60%以上，細胞損傷加劇. 在經(jīng)過2 d和3 d處理后，SOD酶活性降低，但基本保持不變，這可能跟機體的適應性有關.

A)葉綠素a；B)MDA；C)SOD圖4 Ni2+長期脅迫下纖細席藻葉綠素a、MDA、SOD含量的變化Fig.4 Effects of Ni2+ stress on the cellular chlorophyll a, MDA and SOD content of Phormidium tenue

3 討論

藻類在遭受環(huán)境脅迫時，其光合作用首先受到影響. 光合電子傳遞是在PSⅠ和PSⅡ兩個光化學系統(tǒng)串聯(lián)進行，當光能被光合色素吸收后傳遞至PSⅡ系統(tǒng)反應中心，激發(fā)葉綠素P680，引起電荷分離，產(chǎn)生的電子將質醌(PQ)還原后，又傳遞至細胞色素b6f復合體，再由電子載體質藍素(PC)轉移至PSⅠ，這種電子傳遞過程中產(chǎn)生的光合膜兩側的質子濃度差推動合成ATP和NADPH[9]. 而葉綠素熒光(O-J-I-P test)能夠直觀反映植物光合作用的情況，因此常用來研究和探測環(huán)境脅迫對植物光合作用生理的影響[10].

Ni2+脅迫下，纖細席藻的OJIP曲線形狀改變，熒光產(chǎn)量下降，J、P相降低，當Ni2+達到100 mg/L時，J、I、P相完全消失，纖細席藻完全喪失光合活性. 而外源添加細胞保護劑ASC和NAC能夠一定程度地緩解環(huán)境脅迫對植物造成的損傷.NAC是維持細胞正常生理代謝的含巰基化合物，能夠在DNA損傷、UV輻射損傷、重金屬脅迫等方面發(fā)揮保護作用,其解毒機制可能表現(xiàn)在直接清除ROS、補充減少的GSH兩方面[11]. 實驗表明在外源ASC和NAC預處理纖細席藻后，相比未經(jīng)預處理的處理組，葉綠素熒光誘導曲線熒光產(chǎn)量和各J、I、P相下降不明顯，曲線形狀良好，ASC和NAC均對Ni2+脅迫下的纖細席藻的電子傳遞鏈產(chǎn)生緩解損傷作用，反應中心活性甚至有所上升.Ni2+脅迫纖細席藻時，葉綠素a含量隨著Ni2+濃度和時間的增加而呈現(xiàn)下降趨勢，其他研究也表明高濃度Ni2+抑制葉綠素的合成[5，12]，影響光合作用.

重金屬脅迫不僅引起光合作用的變化，還會導致自由基積累造成細胞氧化損傷. MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，反映了細胞氧化損傷的程度. SOD是清除活性氧的第一道防線，是抗氧化系統(tǒng)重要的保護酶之一. Ni2+脅迫纖細席藻時，所有處理組的MDA含量均低于空白組，并隨著處理時間的延長而逐漸降低，同時，SOD活性在低濃度處理1 d后大幅上升，最高高于空白組43.32%，隨著處理時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)了在低濃度Ni2+脅迫下纖細席藻的抗氧化酶活性升高，清除了自由基，因而MDA含量下降，而高濃度Ni2+脅迫纖細席藻在第1 d處理后已經(jīng)失去細胞活性. Tian等[13]研究發(fā)現(xiàn)杜氏鹽藻隨著在UV-B輻射脅迫時間延長，其SOD、CAT和POD活性均發(fā)生先升高后降低的現(xiàn)象.

[1] 劉國棟. 植物營養(yǎng)元素-Ni[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報，2001，7(1)：103-108.

[2] 裴國鳳，胡 江，王 青，等.東湖圍隔與主體湖區(qū)浮游植物群落結構的比較研究[J]. 中南民族大學學報(自然科學版)，2016，35(3)：21-25

[3] 金 琎. 錳、鎳、鉻對藻類生長影響的初步研究[J]. 蘇州科技學院學報,1991，8(2)：37-42.

[4] 謝作明, 陳蘭洲, 李敦海, 等. 土壤絲狀藍藻在荒漠治理中的作用研究[J].水生生物學報，2007，31(6)：886-890.

[5] 吳賽君, 周香君, 趙 劍, 等. 鎳和砷對銅綠微囊藻光合效應的影響[J]. 環(huán)境科學與技術，2015，38(10)：27-31.

[6] 李合生, 孫 群, 趙世杰, 等. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000：134-138.

[7] Alexieva V, Sergiev I, Mapelli S, et al. The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat [J]. Plant Cell Environ, 2001, 24(12):1337-1344.

[8] Giannopolitis C N, Ries S K. Superoxide dismutases: occurrence in higher plants [J]. Plant Physiol, 1977, 59(2): 309-314.

[9] 高坤山.藻類固碳-理論、進展、方法[M]. 北京：科學出版社,2014:18-21.

[10] Chen L，Xie M，Bi Y，et al. The combined effects of UV-B radiation and herbicides on photosynthesis，antioxidant enzymes and DNA damage in two bloom-forming cyanobacteria [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2012，80：224-230.

[11] Hur J M, Hyun M S, Lim S Y, et al. The combination of berberine and irradiation enhances anti-cancer effects via activation of p38 MAPK pathway and ROS generation in human hepatoma cells [J]. J Cell Biochem. 2009, 107(5): 955-964.

[12] 魯 艷, 李新榮, 何明珠, 等. 重金屬對鹽生草光合生理生長特性的影響[J].西北植物學報, 2011，31 (2) ：370-376.

[13] Tian J Y, Yu J. Changes in ultrastructure and responses of antioxidant systems of algae(Dunaliellasalina) during acclimation to enhanced ultraviolet-B radiation [J].Journal of Photochemistry and Photobiology B:Biology,2009,97(3):152-160.

TheResponsesofPhormidiumtenueontheStressofHeavyMetalNickel

ChenLanzhou1,WangJing1,WuYanfang2,KeTan1,LiangYanan2,LiuSiyao1

(1 School of Resource & Environmental Science,Hubei Research Center of Environment Remediation Technology, Wuhan University,Wuhan 430072, China;2 Wuhan Wenke Ecological Environment Ltd.,Wuhan 430000,China)

The effects of nickel onPhormidiumtenue, including photosynthetic activity, antioxidant enzymes and carbohydrate metabolism were investigated. It was found that fluorescence intensity decreased rapidly in the first 10 min after Ni2+was added into the system, and partly recovered to the normal. Ni2+contents could inhibit the fluorescence production ofP.tenueand aggravated as the increase of Ni2+concentration, even O-I-J-P phases of chlorophyll a fluorescence transients disappeared absolutely as well asFv/Fmwith 100 mg/L Ni2+. The two antioxidants, ASC and NAC, were able to relieve the stress of Ni2+onP.tenue, and ASC was better at protecting capacity, while the anti-oxidation effects decreased as extension of treatment time. The chlorophyll a content,Fv/Fmand photosynthetic parameters(ET0/ABS、ET0/TR0、RC/CS0) decreased significantly after Ni2+stressing for 24 h, meanwhile SOD activity oppositely increased to defend against stress of Ni2+. The results indicated that Ni2+had an inhibitory effect on photosynthesis ofP.tenue, and antioxidants could relieve effectively the inhibition, which could increase the absorption efficiency and recycling utilization of algae as bio-adsorbents.

Phormidiumtenue; Ni; chlorophyll a fluorescence transients; antioxygen system

2017-09-12

陳蘭洲(1976-)，男，教授，博士生導師，博士，研究方向：環(huán)境生物學，E-mail:chenlz@whu.edu.cn

國家自然科學基金資助項目(31370421)；湖北省技術創(chuàng)新專項(重大項目，2016ACA162)

X172

A

1672-4321(2017)04-0045-06