乳腺癌線粒體細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變檢測

閆斌 韓麗紅 于躍利

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。近年來，線粒體DNA（m itochond rial DNA，m tDNA）突變與腫瘤關(guān)系的研究越來越受到人們的重視，并且在多種人類腫瘤中都已檢測到m tDNA突變。本研究擬通過對乳腺癌組織m tDNA的細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)測序分析，了解中國人乳腺癌m tDNA的細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ的突變情況，以期為乳腺癌病因?qū)W的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床乳腺癌的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)收集2008年1月～2009年1月在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科切除的乳腺癌組織標(biāo)本20例，以及對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，標(biāo)本取回后于-80℃冰箱保存，均經(jīng)該院病理科證實(shí)為乳腺癌。

1.2 乳腺癌組織標(biāo)本m tDNA的細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)PCR擴(kuò)增

按照DNA提取試劑盒（（Prom gea公司）說明書提取20例乳腺癌組織和癌旁組織的DNA。通過軟件分析設(shè)計(jì)出一對引物，上游引物：5’-atggcacatgcagcgcaag t-3’，下游引物：5’-ggtaaatacgggccctatttc-3’。PCR反應(yīng)體系50μL，水33.5μL，10×bu ffer（無M g2+）5μL，上、下游引物各1μL，4×dNTP4μL，25mM的Mgcl24μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（試劑均來自Promega公司），DNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5m in；94℃15s，65℃30s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120V，電泳30m in。凝膠成像分析系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。

1.3 測序及分析

由百泰克公司使用A BI3730X L測序儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序果用Bioed it軟件進(jìn)行分析，與Gen Ban k序列（AC_000021）對比，在PUBMED網(wǎng)上進(jìn)行氨基酸序列比對，確定是否為突變。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，見圖1。

2.2 細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

見表1。20例乳腺癌患者癌組織中共有4例m tDNA細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)存在突變，突變率為20%。癌旁組織中共有2例m tDNA細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)存在突變，突變率為10%。在20例乳腺癌組織中共有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變，其中引起編碼氨基酸改變的突變有1個(gè)。

3 討論

腫瘤是多因素多步驟發(fā)展的產(chǎn)物，各種致癌物既然能有效地作用于m tDNA引起其產(chǎn)生與腫瘤相關(guān)的遺傳改變，那么m tDNA在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)意義必將得到重視。因此，深入研究腫瘤細(xì)胞m tDNA的結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控變化，探討m tDNA突變與腫瘤的關(guān)系，對闡明細(xì)胞的癌變機(jī)制具有重要意義。目前已知多種腫瘤與m tDNA的突變有關(guān)，但對于它們的研究還只處于起步階段，還沒有得到m tDNA與細(xì)胞癌變直接相關(guān)的證據(jù)[1]。但有研究表明在小鼠癌細(xì)胞系中使用胞質(zhì)雜交技術(shù)代替內(nèi)生的m tDNA，結(jié)果顯示m tDNA突變能夠通過提高癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[2]。

表1 20例乳腺癌組織和癌旁組織中細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ突變情況

圖1 乳腺癌組織細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

m tDNA突變已在多種人類惡性腫瘤中被證實(shí)，m tDNA自身的易受損性和組成性的氧化壓力使其缺陷成為惡性細(xì)胞的重要特征之一。但是，目前人們研究D-Loop區(qū)突變的比較多。本研究側(cè)重于研究細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ區(qū)突變，國內(nèi)鮮有報(bào)道。

細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ是細(xì)胞色素氧化酶的活性中心，是細(xì)胞色素C電子傳遞的入口，也是細(xì)胞色素氧化酶電子泄露產(chǎn)生活性氧的主要部位，因此保持細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ的正常結(jié)構(gòu)和功能對于維持正常的線粒體功能和細(xì)胞能量代謝具有重要作用。細(xì)胞色素氧化酶基因的突變不僅導(dǎo)致突變部位附近殘基的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)環(huán)境發(fā)生極大的變化（包括電荷性質(zhì)、親疏水性質(zhì)和空間特性），直接影響了酶復(fù)合物的形成，而且該酶幾個(gè)亞單位之間相互作用區(qū)域受到了影響，整個(gè)酶分子的穩(wěn)定性大大下降[3]。大量證據(jù)表明，細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞質(zhì)是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步驟。凋亡過程中細(xì)胞色素C的釋放是線粒體外膜通透性增高的結(jié)果[4]。線粒體在凋亡過程中起中心控制作用，而細(xì)胞色素C的釋放則是支配細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。有關(guān)這一信號途徑及其相關(guān)事件的認(rèn)識，對進(jìn)一步了解凋亡的正常生理和病理過程，及其在腫瘤中的失調(diào)控具有重要意義。

我們的研究在乳腺癌患者中細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變率為20%，說明了在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中線粒體細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系。這些改變中，究竟哪些是多態(tài)性，哪些是與疾病相關(guān)的突變目前尚不清楚。這種突變的意義是正常多態(tài)性還是與乳腺癌密切相關(guān)尚不清楚，結(jié)合文獻(xiàn)我們認(rèn)為，突變導(dǎo)致編碼氨基酸的改變可能引起線粒體功能異常，從而對乳腺癌的發(fā)病產(chǎn)生一定影響。雖然根據(jù)我們的結(jié)果尚不能認(rèn)為m tDNA突變在乳腺癌發(fā)病中起決定性的作用，但m tDNA突變可能是發(fā)病過程中的一個(gè)前期或伴隨現(xiàn)象，即這種突變可能在乳腺癌的發(fā)病前就存在于體細(xì)胞線粒體，提高了發(fā)生乳腺癌的易感性。

在我們研究的乳腺癌組織中同樣有胞質(zhì)異質(zhì)性：線粒體幾乎存在于人體的所有細(xì)胞中，每個(gè)細(xì)胞中含有成百上千個(gè)線粒體，因此部分細(xì)胞在連續(xù)分裂過程中發(fā)生有絲分裂遺傳演變而導(dǎo)致組織中同時(shí)存在含野生型和突變型的兩種細(xì)胞，這種狀態(tài)稱為線粒體的胞質(zhì)異質(zhì)性。線粒體異質(zhì)性是乳腺癌患者的一種較為普遍的現(xiàn)象。譚氏等研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中約半數(shù)體細(xì)胞性突變處于異質(zhì)狀態(tài)，其原因考慮有兩個(gè)方面：其一，由于在腫瘤標(biāo)本取材過程中受到正常細(xì)胞的少量“污染”，在隨后的反應(yīng)中使得“污染”得到數(shù)萬倍的擴(kuò)增，因此，測序結(jié)果顯示為異質(zhì)狀態(tài)。其二，已觀察到的異質(zhì)性與腫瘤發(fā)生學(xué)上進(jìn)展特征相同，可能代表著腫瘤的真實(shí)現(xiàn)象，而非污染所致。提示分子水平的改變發(fā)生在大體形態(tài)學(xué)變化之前，腫瘤發(fā)生是一個(gè)漸進(jìn)的過程。

乳腺癌中m tDNA突變是比較普遍的，m tDNA突變可能是誘導(dǎo)核DNA突變的內(nèi)源性因素之一。m tDNA突變可能會通過影響呼吸鏈的合成和核DNA與m tDNA基因相互調(diào)控，使核基因突變幾率增大以及引起細(xì)胞凋亡紊亂，對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展可能起著比較重要的作用[5]。

總之，中國人乳腺癌中m tDNA突變是一個(gè)普遍的現(xiàn)象，它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要的作用。細(xì)胞色素氧化酶在人體內(nèi)分布十分廣泛，它的突變與人類疾病發(fā)生有密切的關(guān)系，雖然檢測乳腺癌患者線粒體DNA編碼細(xì)胞色素氧化酶-Ⅱ基因的突變情況，但是突變位點(diǎn)氨基酸序列的改變、多肽疏水性的變化、蛋白質(zhì)空間構(gòu)想的改變等，還有很多問題仍需要進(jìn)一步研究。

[1]張淑萍,宋書娟,李雅軒.人類線粒體DNA突變與癌癥[J].遺傳,2008,30（3）：263-268.

[2]Ishikawa K,Takenaqa K,Akimoto M,et al.ROS generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis[J]. Science,2008,320（5876）：661-664.

[3]蔡黔,周紅,徐淑芬,等.過氧化氫導(dǎo)致線粒體DNA編碼細(xì)胞色素C氧化酶基因突變與其編碼蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004,14（1）：60-68.

[4]李娜,高俊巖,劉敏.細(xì)胞凋亡和腫瘤的關(guān)系研究進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2009,15（16）：13-14.

[5]石楓,曾健.線粒體DNA突變與乳腺癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].廣西醫(yī)學(xué),2007,29（6）：856-858.