高中生物開放式組織培養(yǎng)實驗設(shè)計

楊欣悅

摘 要：實驗?zāi)康模嚎疾椴煌志鷦τ鷤M織的形成有何影響，其次尋找接種方式、取材部位等因素對誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳條件，在組織培養(yǎng)過程中，掌握外植體消毒的注意事項，合理選取和控制培養(yǎng)條件。實驗材料：月季花；市售多菌靈和大蒜素。實踐方法：培養(yǎng)基配制，消毒，接種，條件設(shè)置。實驗結(jié)果：多菌靈在開放式組培中的抑菌效果好，且兩者的成活率都達到或超過了50%。

關(guān)鍵詞：開放式組織培養(yǎng)；抑菌劑；效果

中圖分類號：G63 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-9132（2017）03-0140-02

DOI：10.16657/j.cnki.issn1673-9132.2017.03.090

科學(xué)研究表明，植物細(xì)胞處于離體狀態(tài)時，在一定營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，表現(xiàn)出全能性，能發(fā)育成完整植株。高中生物中通過植物的組織培養(yǎng)實驗來學(xué)習(xí)植物的無性繁殖，組織培養(yǎng)是把植物的器官、組織以至單個細(xì)胞，使其在人工條件下，繼續(xù)生長，甚至分化發(fā)育成一完整植株的過程，為保證植株成活率，此操作通常在無菌操作環(huán)境進行。

在實驗的實施過程中，我們發(fā)現(xiàn)植株體幾乎都受到污染發(fā)霉，成活率不到10%，究其原因主要有兩個方面：一是班級規(guī)模的操作流程不可避免地帶來了很多不確定的污染因素，難以達到植物組織培養(yǎng)對無菌要求極為嚴(yán)格的條件；二是在培養(yǎng)的過程中，需要保持恒溫的生長環(huán)境以及嚴(yán)格的光照時間，對前者尤其有較高的要求。

開放式組織培養(yǎng)是通過在培養(yǎng)基中加入抑菌劑來代替高壓滅菌，避免了絕對的無菌環(huán)境，使植物在相對開放的條件下可以良好生長。這種方法能夠降低植物培養(yǎng)繁殖的成本，目前在多種花卉和經(jīng)濟類作物的工廠化育苗生產(chǎn)實踐中已得到推廣應(yīng)用。隨著開放式組織培養(yǎng)技術(shù)研究的成熟，在高中生物組織培養(yǎng)實驗中應(yīng)用這一方法，能顯著提高實驗的成功率，改善實驗條件，尤其是邊遠(yuǎn)地區(qū)學(xué)校的實驗環(huán)境。

選擇合適的抑菌劑、外植體是開放式組織培養(yǎng)實驗設(shè)計的關(guān)鍵要素。參考相關(guān)文獻資料及中醫(yī)理論，我們選取了市售多菌靈和大蒜素作為抑菌劑。大蒜素也可采用自制的方法獲得，文獻[1]提供了相關(guān)制作方法及濃度參數(shù)。

一、實驗?zāi)康暮头椒?/p>

實驗要求能閱讀植物組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻資料，考查不同抑菌劑對愈傷組織的形成有何影響，其次尋找接種方式、取材部位等因素對誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳條件，在組織培養(yǎng)過程中，掌握外植體消毒的注意事項，合理選取和控制培養(yǎng)條件，對實驗過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象及時觀察記錄和分析，加強理論與實踐的聯(lián)系，深化對理論知識的理解。根據(jù)相關(guān)理論和文獻資料，我們設(shè)計了以誘導(dǎo)愈傷組織為主的開放式組織培養(yǎng)實驗方案。

（一）外植體材料：月季花

本實驗材料取自盆栽的月季，植物葉片和莖段均是誘導(dǎo)愈傷組織和進行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的理想材料，葉片誘導(dǎo)率稍高于莖段，能達到90%以上，莖段培養(yǎng)則最簡便，成苗速度最快，且以莖段中芽為最好，接種后，中段芽第5 天左右就能萌發(fā)。為避免誤差和便于得出結(jié)果，在選擇外植體時最終確定選用帶腋芽部分的莖段做外植體材料。

（二）主要試劑

MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1mg /mL6-BA、0. 5mg /mL NAA、1mol /L NaOH溶液、市售大蒜素、市售多菌靈粉劑。

（三）實驗方法

培養(yǎng)基配制：取2只2000mL規(guī)格的錐形瓶，分別標(biāo)記大蒜素、多菌靈。分別稱量MS 干粉培養(yǎng)基50g 放于錐形瓶中，加800mL 蒸餾水在電熱爐上慢慢攪拌煮沸至溶液完全透明，然后加入蒸餾水將溶液定溶至1000mL。待溶液冷卻至40℃ ～ 50℃ 時，分別在以上2 瓶中分別加入0.15g/mL大蒜素溶液10mL，稀釋600倍的多菌靈溶液，然后加入6-BA 1mg /mL 2mL，NAA 0. 5mg /mL 0. 5mL，混勻后，調(diào)節(jié)pH 到6. 8，然后將培養(yǎng)基倒入組培瓶中擰緊，每瓶50mL，分別標(biāo)記所加物質(zhì)作為記號，水平放置至凝固。

消毒：剪取當(dāng)年抽生側(cè)芽飽滿的幼嫩莖段，剪去頂部和基部并去葉，剪成2cm長帶有側(cè)芽的莖段，自來水沖洗10-20分鐘；75%乙醇浸泡30秒，再用0.1%Hgcl2溶液滅菌5-10分鐘，無菌水沖洗4-5次，獲得無菌苗備用。

接種：從瓶中取出月季無菌苗剪取腋芽段插入培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基平面不沒過腋芽處為準(zhǔn)，擰上蓋子，放入光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。在外植體的接種時采用了垂直接種，斜向上45度接種，采用這樣的接種方式，腋芽再生芽數(shù)多，且生長健壯，這與植物的生長習(xí)性有一定關(guān)系。

培養(yǎng)條件：設(shè)置為一般植物組織培養(yǎng)的條件，溫度控制在24℃左右，光照時間為12h/天，光照強度為1000～2000Lx，實驗接種后先暗室培養(yǎng)一周，再在光照下培養(yǎng)。定期觀察記錄，隨時取走出現(xiàn)嚴(yán)重污染的組培瓶。

二、結(jié)果與分析

經(jīng)過20天觀察， 兩種培養(yǎng)方式均獲誘導(dǎo)獲得了愈傷組織，統(tǒng)計結(jié)果如下表。

通過對這兩種抗菌物質(zhì)的抗菌效果的比較，得出多菌靈在開放式組培中的抑菌效果較好，且兩者的成活率都達到或超過了50%。這種開放式的方法降低了技術(shù)難度，可操作性更強，設(shè)備投入成本較低，對于建設(shè)植物組織培養(yǎng)實驗有較大的可行性。出芽和生根的再分化實驗過程，可參考相關(guān)資料，探究由愈傷組織誘導(dǎo)出芽及生根所需培養(yǎng)基和生長素的最佳濃度配比，調(diào)節(jié)植物激素的濃度繼續(xù)實施。

在開放式組培實驗中，不同的外植體選擇何種抑菌劑及其濃度是非常關(guān)鍵的因素，需參考相關(guān)文獻及各種生產(chǎn)實踐進一步摸索。多菌靈是一種高效廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，其通過抑制病原菌紡錘體的形成來影響細(xì)胞分裂，對多數(shù)半知菌和子囊菌具有抑制作用。大蒜提取物中主要成分是大蒜素，具有較強的抗菌消炎作用，對多種球菌、桿菌、真菌、病毒等均有抑制或殺滅作用，其在低濃度時能夠抑制真菌生長，在高濃度時可完全殺死真菌，且大蒜素是生物農(nóng)藥，對植物生長影響較小，這兩種抑菌劑的應(yīng)用范圍相對比較廣泛。

以開展開放式組培條件探究實驗為契機，培養(yǎng)學(xué)生探究實驗，可以從無菌和抑菌等多種角度對植物組織培養(yǎng)進行探究，在高中學(xué)生中開展這方面的課題研究，不僅能鍛煉學(xué)生多方面思考創(chuàng)新的能力，并且緊密結(jié)合生產(chǎn)實際，是實驗課程改革思路的又一探索模式。

參考文獻：

[1] 王曉煌，黃勝琴，李玲. 4種抑菌劑在煙草開放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015， 42（5）：58-62.

[2] 王艷紅，龔束芳，車代弟.豐花月季愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，38（2）：161-165.