抗犬細(xì)小病毒單鏈抗體庫構(gòu)建及其親和力檢測

李德山，車瑞香，郭 瑞，王宇陽，黃 濤，郭笑辰，任桂萍

抗犬細(xì)小病毒單鏈抗體庫構(gòu)建及其親和力檢測

李德山，車瑞香，郭 瑞，王宇陽，黃 濤，郭笑辰，任桂萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

為獲得高親和力抗犬細(xì)小病毒單鏈抗體，構(gòu)建抗犬細(xì)小病毒（CPV）細(xì)菌展示單鏈抗體文庫。研究提取犬脾臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以此為模板，分別擴(kuò)增犬抗體VH和VL編碼序列，插入克隆載體pTlinker。利用SfiⅠ酶切位點(diǎn)將scFv基因構(gòu)建至細(xì)菌展示載體pBSD中，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α構(gòu)建pBFD-scFv細(xì)菌展示庫。通過標(biāo)記FITC的VP2蛋白，利用流式細(xì)胞術(shù)篩選12株陽性scFv。將12株scFv基因分別插入pET-28a，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-scFv。轉(zhuǎn)化到E.coli Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得約28 ku目的蛋白。經(jīng)ELISA檢測，純化scFv對VP2蛋白P/N值均大于2.1，其中scFv-23、scFv-33、scFv-34對VP2蛋白親和力較強(qiáng)。研究通過免疫本動物源動物，在獲得高價抗體同時，避免傳統(tǒng)單克隆抗體的免疫排斥現(xiàn)象；結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)菌展示技術(shù)可對單鏈抗體文庫高效、快速篩選?？谷?xì)小病毒同源單鏈抗體研究在填補(bǔ)市場同源基因工程抗體空白的同時，可為研制具有中和活性全長抗體奠定基礎(chǔ)。

CPV；單鏈抗體；流式細(xì)胞術(shù)；親和力

犬細(xì)小病毒病是犬細(xì)小病毒引起的急性傳染病，表現(xiàn)為出血性腸炎或非化膿性心肌炎，多發(fā)生于幼犬，病死率10%~50%[1]。主要特征是劇烈嘔吐、腹瀉、糞便惡臭、出血性腸炎及白細(xì)胞數(shù)量減少[2]；可感染不同年齡、性別和品種犬，全年發(fā)病率較高。CPV屬細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬，無囊膜結(jié)構(gòu)，核衣殼為對稱等軸20面體單鏈DNA分子。CPV僅一個抗原型，但不同亞型、毒株間抗原性存在差別。目前CPV-2已突變?yōu)镃PV-2a亞型、CPV-2b亞型、CPV-2c（a）亞型和 CPV-2c（b）亞型[3]。國內(nèi)2011年首次檢測到CPV-2c亞型[4]，但目前流行CPV主要以CPV-2a亞型和CPV-2b亞型為主。CPV核酸呈線性單鏈，可編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，其中CPV編碼VP1，VP2，NS1，NS2蛋白是其主要生物學(xué)特性及抗原性決定單位；VP1和VP2為結(jié)構(gòu)蛋白[5]。VP2既是CPV衣殼蛋白主要成分，包含CPV中和抗原位點(diǎn)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6-7]。

目前，臨床治療犬細(xì)小病毒病主要通過注射抗血清、傳統(tǒng)單克隆抗體等藥物?？寡宕嬖谒絺鞑ゼ膊★L(fēng)險，傳統(tǒng)單克隆抗體盡管治愈率較高，但注入體內(nèi)會出現(xiàn)半衰期短、免疫排斥等現(xiàn)象。本研究中犬源基因工程重組抗體可克服上述缺點(diǎn)，具有本動物源、高親和性等優(yōu)點(diǎn)，在犬細(xì)小病毒病治療方面日益受到關(guān)注。

單鏈抗體作為重要基因工程抗體，由三部分構(gòu)成，抗體輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)及一段連接橋梁多肽鏈[8]。單鏈抗體不僅具較強(qiáng)靶向性，同時不易解離、結(jié)構(gòu)簡單、易于操作及改造，利于抗體庫篩選[9-10]。

根據(jù)細(xì)菌顆粒較大細(xì)菌展示技術(shù)，可將抗體展示于細(xì)菌表面，用熒光標(biāo)記物通過流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）實時監(jiān)測抗原和抗體結(jié)合情況[11]，分選親和力高抗體表達(dá)菌株[12-13]。本研究應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)膜展示技術(shù)，原理是外源基因與NlpA信號肽共同融合表達(dá)[12]，將目的蛋白展示于細(xì)菌內(nèi)膜。NlpA信號肽可將與其融合目的基因運(yùn)送至細(xì)菌周質(zhì)空間，在跨膜過程中利用CDQSSS 6個氨基酸與細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)脂類形成脂苷鍵，錨定于細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)[14-15]，形成細(xì)菌展示抗體庫。利用溶菌酶處理細(xì)菌外膜，通過熒光標(biāo)記特異性抗原結(jié)合FCM篩選抗體庫。該方法利用6個氨基酸組成短肽錨定外源蛋白，對表達(dá)抗體蛋白構(gòu)象無影響，并保持基因型和表型聯(lián)系[16]。本研究旨在篩選具有親和力抗CPV基因重組抗體，為后續(xù)研究具有中和活性抗體奠定基礎(chǔ)，中和抗體可與病毒上中和表位結(jié)合，阻止病毒與細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合[17]，防治疾病。試驗成功構(gòu)建抗CPV細(xì)菌展示單鏈抗體（scFv）庫并表達(dá)抗CPVscFv，采用ELISA試驗方法檢測純化后抗體，獲12株具有較高特異性和親和力抗CPV的scFv，為抗CPV基因工程抗體藥物篩選提供依據(jù)，也為研制中和活性全長抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

克隆載體pMD19-T Simple Vector購自TaKaRa公司，原核表達(dá)載體pET-28a（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室保存），scFv抗體文庫構(gòu)建載體pTlinker（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室保存），細(xì)菌表面展示載體pBSD（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥教研室保存）。HRP-Sheep anti-Canine IgG（H+L）購自abcam公司，VP2、FITC標(biāo)記VP2及免疫狗的陽性血清由本實驗室制備。限制性內(nèi)切酶、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，抗生素，RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa公司；CPV抗體檢測試紙條購自ASan Easy Test。

1.2 犬脾臟RNA提取和cDNA合成

CPV抗體檢測試紙條檢測抗體水平，取免疫后犬全血，滴入檢測孔30 μL，同時滴入90 μL檢測液，靜止20 min后讀取結(jié)果。取HI＞320，抗體水平呈極強(qiáng)陽性，按照RNA提取試劑盒步驟，提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄合成犬cDNA。

1.3 細(xì)菌展示scFv抗體庫構(gòu)建

1.3.1 大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備

挑取凍存大腸桿菌DH5α菌液，于LB固體平板培養(yǎng)基表面劃線，37℃培養(yǎng)過夜，同時設(shè)含Amp LB培養(yǎng)板劃線培養(yǎng)作對照。次日挑取中等大小單一菌落，接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)約10 h。用接種環(huán)沾取菌液接入10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)約10 h。將上述已活化菌種以1∶1 000比例接入200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)0.35~0.40時，收集菌液至50 mL離心管中，4℃、3 000 r·min-1，離心10 min。棄上清，加入40~50 mL預(yù)冷去離子水重懸菌體，4℃、3 000 r·min-1，離心10 min，重復(fù)操作一次。棄上清，加入40~50 mL預(yù)冷10%甘油重懸菌體，4℃、3 000 r·min-1，離心10 min，重復(fù)操作一次。取上清，加少量新鮮預(yù)冷10%甘油將菌體重懸后分裝，每管100 μL凍存?zhèn)溆谩?/p>

每管感受態(tài)細(xì)胞加5 ng pUC19標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，3 kV、25 μF、200 Ω條件下電轉(zhuǎn)，400 μL SOC培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布平板，37℃培養(yǎng)12~16 h，次日觀察電轉(zhuǎn)化結(jié)果并計算轉(zhuǎn)化率。

1.3.2 pTlinker-scFv庫構(gòu)建

根據(jù)GenBank上已發(fā)表抗體核酸序列，分析可變區(qū)骨架區(qū)，設(shè)計PCR擴(kuò)增簡并引物，在重鏈上游先后引入SfiⅠ和HindⅢ兩個酶切位點(diǎn)，下游引入NheⅠ酶切位點(diǎn)；輕鏈上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ和SfiⅠ兩個酶切位點(diǎn)。引物由哈爾濱博仕生物有限公司合成。

以犬脾臟cDNA為模板，VH上游引物、VH下游引物擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因，將VH及pTlinker酶切片段利用T4Ligase連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化構(gòu)建VH抗體庫。次日，收集所有菌落并提取質(zhì)粒，BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，同時BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切VL回收產(chǎn)物，T4Ligase連接，連接電轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，收集菌落并提取質(zhì)粒，即為pTlinker-scFv庫。

1.3.3 pBSD-scFv細(xì)菌展示抗體文庫構(gòu)建

利用SfiⅠ酶切割分離VH-linker-VL片段與SfiⅠ酶切細(xì)菌展示載體pBSD相連，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，構(gòu)成pBFD-scFv細(xì)菌展示庫。

1.4 流式細(xì)胞儀篩選細(xì)菌展示scFv庫

pBFD-scFv庫所有菌落，用液體培養(yǎng)基稀釋至OD600≈0.2， 37 ℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)OD600≈0.4后，加IPTG至終濃度為0.25 mmol·L-1，37℃搖床誘導(dǎo)4 h。

取適量樣品組和對照組培養(yǎng)物于1.5 mL Eppendorf管，離心，收集菌體；沉淀用350 μL Sucrose（0.75mmol·L-1）/Tris（0.1mol·L-1）solution 充分懸起；加35 μL（10 mg·mL-1）新鮮配制溶菌酶；同時伴隨渦旋，逐滴加700 μL EDTA溶液（1 mmol·L-1）并混勻；冰上孵育15 min；加入50 μL MgCl2溶液（0.5 mol·L-1）混勻，冰上孵育10 min，離心，原生質(zhì)球沉淀用PBS溶液重懸滌[17]，離心；沉淀用100 μL PBS重新懸浮，含10 μL 2%（質(zhì)量體積比）BSA貯存液和5 μg FITC標(biāo)記后重組VP2蛋白100 μL PBS（pH7.4）重新懸起原生質(zhì)體，避光冰上孵育1 h，離心，1 mL PBS洗滌沉淀3次，離心棄上清，吸盡殘液，沉淀用300 μL PBS重懸。

將陰性對照和樣品用流式細(xì)胞儀在488 nm波長激光下檢測，相對于陰性對照，收集熒光強(qiáng)度最高部分。將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α中，構(gòu)建次級篩選庫，按照相同方法第二輪篩選，分選熒光強(qiáng)度較高1%細(xì)胞，提取質(zhì)粒后再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建成三級篩選庫，作第三輪篩選。

三輪篩選后，平板上挑取100個單菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀檢測，檢測操作同篩選方法，將熒光信號強(qiáng)于陰性對照克隆提取質(zhì)粒，PCR及酶切鑒定，測定并分析克隆序列。

1.5 抗CPV scFv基因的克隆及重組表達(dá)

1.5.1 引物設(shè)計與合成

以scFv-2、scFv-11、scFv-12、scFv-13、scFv-23、scFv-25、scFv-31、scFv-33、scFv-34、scFv-35、scFv-65、scFv-84為模板，用Primer premier 5軟件設(shè)計12對引物，在上游引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ，下游引入酶切位點(diǎn)XhoⅠ。引物由哈爾濱博仕生物有限公司合成。

1.5.2 構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-scFv

以陽性重組質(zhì)粒pBSD-scFv為模板，PCR擴(kuò)增scFv基因，膠回收后用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，獲得pET28a載體和scFv基因用T4DNA連接酶，16℃金屬浴連接過夜。連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，超凈工作臺中挑取單菌落，次日提取質(zhì)粒，將雙酶切鑒定正確后質(zhì)粒測序。菌液與50%甘油混合，-80℃保存。

將pET28a空載體及陽性重組質(zhì)粒pET28a-scFv接種到含有100 μg·mL-1卡那霉素 LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜，取1mL菌液，加入500mL錐形瓶擴(kuò)大培養(yǎng)?；罨缶?7℃搖床培養(yǎng)2 h至吸光度達(dá) 0.6~0.9。加入IPTG至濃度為0.25 mmol·L-1，37℃誘導(dǎo)4 h。另設(shè)不加IPTG對照組。收集誘導(dǎo)菌和對照菌，經(jīng)超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀，SDS-PAGE電泳分析。

1.6 包涵體純化

誘導(dǎo)后菌體離心棄上清，適量PBS重懸并加溶菌酶至終濃度為1 mg·mL-1，冰上放置60 min，超聲破碎，4℃，12000 r·min-1離心30 min，收集沉淀、洗滌，用溶解緩沖液（8 mol·L-1尿素溶液，pH 8.0）充分溶解。以尿素梯度性降低比例溶解緩沖液和復(fù)性緩沖液（10 mmol·L Tris-buffer，pH 8.0）混合物平衡HiLoad 16/60 Superdex75 pg柱（購自GE公司）。溶于溶解緩沖液的蛋白上柱，復(fù)性緩沖液緩慢洗脫蛋白，PBS過夜透析，SDS-PAGE電泳分析純度。

1.7 ELISA檢測重組scFv親和力和特異性

純化后scFv蛋白分別用包被液稀釋至3.125、6.25、12.5、25、50和100 μg·mL-1，包被于ELISA板，同時設(shè)置只加顯色液和終止液陰性對照1、不加二抗陰性對照2、不加一抗陰性對照3和hIL-1β代替VP2蛋白陰性對照4，ELISA方法檢測scFv對VP 2蛋白的親和力和特異性，樣品及對照均設(shè)置三個平行孔。用5%脫脂奶粉37℃封閉，加入50 μg·mL-1VP2蛋白100 μL，37℃孵育，1∶50倍稀釋犬血清作為一抗，1∶100 000倍HRP-Sheep anti-Canine IgG（H+L）為二抗，顯色液顯色，加入終止液，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm下OD值，P/N≥2.1判為陽性。具體操作見文獻(xiàn)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌展示scFv庫構(gòu)建

以合成cDNA第一條鏈為模板，利用VH上下游簡并引物擴(kuò)增重鏈可變區(qū)，如圖1A所示，VH片段大小約380 bp。利用VL上下游簡并引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)，如圖1B所示，VL片段大小約338 bp。將二者膠回收產(chǎn)物分別插入克隆載體pTlinker中。利用sfiⅠ限制性內(nèi)切酶，分別對pTlinker-scFv和pBSD載體酶切，膠回收后連接酶切產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建細(xì)菌展示scFv庫（見圖1 C），scfv片段長度約750 bp，感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率為1.1×109。

圖1 細(xì)菌展示scFv庫構(gòu)建Fig.1 Construction of pBSD-scFv library

2.2 細(xì)菌展示scFv庫篩選

將含有pBSD-scFv抗體庫陽性菌誘導(dǎo)表達(dá)，制備展示所需原生質(zhì)體，用已標(biāo)記FITC VP2蛋白孵育，同時將空白菌DH5α（不含pBSD-scFv重組質(zhì)粒）以同樣方法孵育，設(shè)為陰性對照。流式細(xì)胞儀在488 nm波長激光下，以陰性對照為標(biāo)準(zhǔn)檢測并分選待檢樣品。

由圖2（A、B）可見，含有pBSD-scFv抗體庫陽性菌峰相對陰性峰具陽性拖尾，陽性菌比例達(dá)9.7%，說明部分陽性菌可表達(dá)與CPV VP2蛋白特異性結(jié)合scFv蛋白。收集陽性部分菌物，提取質(zhì)粒。

將提取質(zhì)粒重新電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli DH5α，展開2輪、3輪篩選，如圖2（C、D）所示，陽性部分不斷增加。第2輪篩選，陽性原生質(zhì)體比例升至28.9%，第3輪篩選，陽性率升至47.5%。

經(jīng)過第3輪篩選后，收集原生質(zhì)體，提取質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)化，挑取單菌落，分別擴(kuò)增培養(yǎng)并處理后，流式細(xì)胞儀檢測，獲得12株陽性峰偏移率較高單鏈抗體。分別命名為pBSD-scFv-2、pBSD-scFv-11、 pBSD-scFv-12、 pBSD-scFv-13、pBSD-scFv-23、 pBSD-scFv-25、 pBSD-scFv-31、pBSD-scFv-33、 pBSD-scFv-34、 pBSD-scFv-35、pBSD-scFv-65、pBSD-scFv-84（見圖3）。

2.3 目的蛋白純化

對重組質(zhì)粒pET28a-scFv作PCR及EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符。測序結(jié)果表明成功構(gòu)建原核表達(dá)載體。

SDS-PAGE分析，可知目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，scFv蛋白分子量約28 ku，與預(yù)期相符（見圖4）。對包涵體變性、復(fù)性、純化及透析，SDS-PAGE分析，約28 ku處出現(xiàn)目的蛋白條帶（見圖5）。

圖2 scFv庫的流式細(xì)胞儀篩選結(jié)果Fig.2 Screening of scFv library by FCM

2.4 ELISA檢測重組scFv與VP2蛋白特異性和親和力檢測

使用本實驗室表達(dá)純化VP2蛋白對12株scFv作ELISA檢測，試驗組數(shù)值均高于對照組，P/N比值均大于2.1，呈陽性。

隨scFv蛋白濃度梯度增加，反應(yīng)數(shù)值呈上升趨勢，且平行性較好。說明12個scFv均可與VP2蛋白特異性結(jié)合，且有一定親和力，其中scFv-23、scFv-33、scFv-34對VP2親和力較強(qiáng)（見圖6）。

圖3 親和能力檢測結(jié)果Fig.3 Affinity detection of scFvs by FCM

圖4 scFv蛋白表達(dá)Fig.4 Expresstion of scFv protein

圖5 目的蛋白純化Fig.5 The purified of scFvs protein

圖6 scFv庫流式細(xì)胞儀篩選結(jié)果Fig.6 Screening of scFv library by FCM

3 討論

單鏈抗體scFv作為基因工程抗體一種形式，具有分子量小，結(jié)構(gòu)簡單，較強(qiáng)靶向性等優(yōu)勢[20-21]。目前，單鏈抗體構(gòu)建主要有兩種方式：①從雜交瘤細(xì)胞株中擴(kuò)增抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)，但構(gòu)建單鏈抗體存在排斥反應(yīng)。②從犬脾臟B淋巴細(xì)胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，獲抗體可變區(qū)。本文選擇免疫本動物源動物犬，通過克隆犬重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，構(gòu)建pBSD-scFv細(xì)菌展示抗體庫。

周兵等應(yīng)用噬菌體展示系統(tǒng)和細(xì)菌展示技術(shù)篩選雞抗體文庫，為應(yīng)用細(xì)菌展示技術(shù)篩選犬抗體文庫提供參考[17]。細(xì)菌展示技術(shù)可根據(jù)需要選擇合適展示系統(tǒng)，控制展示蛋白拷貝數(shù)，根據(jù)需要實現(xiàn)N端或C端融合表達(dá)或嵌合表達(dá)。由于細(xì)菌表面展示系統(tǒng)具細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可應(yīng)用于FACS高通量篩選，提高篩選效率[22-24]。目前，可成功展示抗體片段細(xì)菌展示平臺較少[25-26]，抗體片段分子量偏大、抗體蛋白上與抗原結(jié)合區(qū)域易被封閉、scFv折疊能力有限[27]。本試驗使用免疫后文庫，而非天然抗體庫，抗體基因片段克隆自經(jīng)抗原免疫過供體，因此該文庫具有較強(qiáng)抗原特異性和親和力，細(xì)菌展示系統(tǒng)選擇106庫容量，抗體文庫可滿足本研究需求。

細(xì)菌內(nèi)膜展示技術(shù)與具有高通量、高靈敏度和準(zhǔn)確分選優(yōu)勢的流式細(xì)胞篩選法結(jié)合，將單鏈抗體通過NlpA leader C端6個氨基酸殘基錨定到細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)，通過一系列處理將細(xì)菌外膜穿孔制備為原生質(zhì)體，標(biāo)記FITC VP2蛋白與其孵育后，構(gòu)建抗CPV單鏈抗體庫中獲12株對VP2蛋白具有特異性結(jié)合能力和親和力單鏈抗體，為進(jìn)一步篩選具有中和活性單鏈抗體奠定基礎(chǔ)。

在表達(dá)單鏈抗體時，scFV為單順反子[28-30]，對表達(dá)載體要求較低，選擇pET28a表達(dá)載體表達(dá)，使用Superdex75 pg柱子，將溶于溶解緩沖液蛋白上柱后，復(fù)性緩沖液緩慢洗脫蛋白，將蛋白于PBS中過夜透析，定時更換透析液，為下一步試驗奠定基礎(chǔ)。檢測重組scFv與VP2蛋白特異性和親和力時，應(yīng)設(shè)對照和復(fù)孔。結(jié)果顯示12株scFV均對VP2蛋白具有親和力，其中scFv-23、scFv-33、scFv-34對VP2蛋白親和力較強(qiáng)，后續(xù)將對12株單鏈抗體作中和活性鑒定，確定其是否具有中和病毒能力，構(gòu)建全長抗體[31]。

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Construction and affinity detection of an anti-CPV scFv library

LI Deshan,
CHE Ruixiang,GUO Rui,WANG Yuyang,HUANG Tao,GUO Xiaochen,REN Guiping
(School of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to obtain high affinity anti-canine parvovirus single chain antibody,bacteriadisplayed recombinant scFv libraries of Canine parvovirus were constructed.Total RNA was extracted from the spleen of an immunized canine and reverse transcribed into cDNA as template.VH and VL coding sequences of the canine antibody were inserted into the cloning vector pTlinker,respectively.The scfv gene was constructed into the bacterial display vector pBSD bySfiI digestion site,and the recombinant plasmid was electroconductive intoE.coliDH5αto construct pBFD-scFv bacteria display library.Twelve VP2-binding scFv clones with unique sequences were obtained after screening scFv library by FCM with FITC-labeled VP2.The 12 recombinant scFv genes were inserted into pET-28a to construct the recombinant expression plasmid pET28a-scFv.They were transformed intoE.coliRosetta for induction and expression,in order to obtain about 28 ku of the target protein.ELISA results showed that all scFvs exhibited binding abilities and specifities to VP2,among them scFv-23,scFv-33 and scFv-34 were stronger than others.In this study,canine was immunized in order to acquire high-pricedantibodies,which avoiding the traditional immune rejection of monoclonal antibodies.Flow cytometry and bacterial display technology was combined for screening in more efficient and rapid.Anti-canine parvovirus homologous single-chain antibodies fill the gaps in homologous antibodies in the market and bulid the foundation for the development of full-length antibodies with neutralization activity.

Canine parvovirus;single chain antibody;flow cytometry;bacterial display

R392

A

1005-9369（2017）11-0026-09

時間2017-12-7 12:34:11 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171207.1233.006.html

李德山,車瑞香,郭瑞,等.抗犬細(xì)小病毒單鏈抗體庫構(gòu)建及其親和力檢測[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(11):26-34.

Li Deshan,Che Ruixiang,Guo Rui,et al.Construction and affinity detection of an anti-CPV scFv library[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(11):26-34.(in Chinese with English abstract)

2017-10-15

國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2016YFD0501003）

李德山（1950-），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為生物制藥。E-mail:deshanli@163.com