大豆脂肪酸含量積累動態(tài)及亞麻酸代謝候選基因篩選

李文濱，馮 雷，宋 偉，羅 健，畢文雙，劉 月，徐玲秀，趙 雪

大豆脂肪酸含量積累動態(tài)及亞麻酸代謝候選基因篩選

李文濱，馮 雷，宋 偉，羅 健，畢文雙，劉 月，徐玲秀，趙 雪

（東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所，大豆生物學教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030）

大豆脂肪酸5種組分中亞麻酸含量是影響大豆品質(zhì)主要因素之一，與其他4種脂肪酸比例直接影響大豆油脂品質(zhì)特性及貯運加工，大豆油具有適宜亞油酸與亞麻酸比例。文章通過高效氣相色譜法對品種‘合豐25’（高亞麻酸含量品種，5.94%）與加拿大穩(wěn)定品系‘L-5’（低亞麻酸含量品種，2.75%）及其組配重組自交系群體中選取高/低亞麻酸品系各2份，盆栽試驗分析脂肪酸組分及含量。結(jié)合KEGG中大豆脂肪酸代謝途徑篩選與不飽和脂肪酸代謝相關候選基因，對篩選RIL群體后代品系發(fā)育各時期作實時定量PCR，分析其在‘合豐25’和‘L-5’及后代品系中表達模式。結(jié)果表明，相同基因在不同品種之間對亞麻酸含量調(diào)控機制不同，不同時期基因表達量對亞麻酸積累量具有不同程度影響。研究結(jié)果為探索大豆亞麻酸積累規(guī)律及其候選基因影響，選育理想脂肪酸組分比例大豆新品種提供參考。

大豆；脂肪酸；氣相色譜；實時定量PCR

大豆是重要油料作物之一，是食用植物油主要來源[1-2]。大豆脂肪酸組分配比直接影響大豆油脂營養(yǎng)價值及貯運加工等環(huán)節(jié)，為決定大豆油脂品質(zhì)最重要因素[3-4]。大豆脂肪酸由5種脂肪酸組成，包括飽和脂肪酸：棕櫚酸、硬脂酸；不飽和脂肪酸：油酸、亞油酸、亞麻酸[5-7]。飽和脂肪酸無不飽和鍵，能量低、不易被人體消化吸收，利于大豆油貯存，不飽和脂肪酸以亞油酸為主（約55%），含有兩個雙鍵，易于吸收，是人體必需脂肪酸[8]；亞麻酸（C18∶3）因高度不飽和性易使大豆油氧化變質(zhì)，營養(yǎng)價值低[9]。因此，降低大豆脂肪酸組分中亞麻酸含量成為重要育種目標之一。

大豆脂肪酸遺傳受多基因控制且易受環(huán)境影響[10-12]，脂肪酸組分含量遺傳涉及主效基因和多基因[13]，亞麻酸含量主效基因遺傳率低，棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸主效基因遺傳率均在70%以上[14-15]。Tang等分離獲得5個FAD2基因拷貝[16]。Δ15-脂肪酸脫氫酶（FAD3），為一種微粒體ω-3脫氫酶，是決定亞麻酸產(chǎn)量關鍵酶，Li等從大豆基因組中克隆并分離出4個編碼亞麻酸脫氫酶功能基因，與低亞麻酸含量密切相關[17]。Δ12-脂肪酸脫氫酶（FAD2），是決定亞油酸含量關鍵酶[18]。傳統(tǒng)育種方法改良大豆脂肪酸遺傳進展緩慢。目前，國內(nèi)外大豆育種家利用分子標記挖掘多個與大豆油酸和亞麻酸含量相關QTL[19-21]。宋萬坤等采用QTL元分析方法獲得定位在10個連鎖群上19個QTLs[22]，鄒筱等利用QTL定位發(fā)現(xiàn)11個與油酸、亞麻酸相關標記[23]，南金平等利用回交導入系群體檢測到47個QTLs[24]，但大豆各發(fā)育時期亞麻酸積累及相關基因各時期表達量分析鮮見報道。

本研究通過高效氣相色譜法對品種‘合豐25’（高亞麻酸含量品種，5.94%）與加拿大穩(wěn)定品系‘L-5’（低亞麻酸含量品種，2.75%）及其組配重組自交系群體中選取高/低亞麻酸品系各2份，通過盆栽試驗分析脂肪酸組分、含量及相關性，同時篩選具代表性高/低亞麻酸含量大豆品系，分析不同生育時期亞麻酸含量動態(tài)變化，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫中大豆脂肪酸代謝途徑篩選與不飽和脂肪酸代謝相關基因，分析其表達模式，為探索大豆亞麻酸積累規(guī)律及選育理想脂肪酸組分比例大豆新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

合豐25（高亞麻酸含量品種，5.94%）、加拿大穩(wěn)定品系L-5（低亞麻酸含量品種，2.75%）、雜交組配RIL重組自交系群體F7代。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

試驗于2015年在東北農(nóng)業(yè)大學向陽試驗實習基地進行，從檢測群體中選取高/低亞麻酸品系，高亞麻酸品系JY182、JY142，低亞麻酸品系JY20、JY83作盆栽試驗，定期定量澆水，施肥，生長條件一致環(huán)境下發(fā)育至成熟。盆栽材料定期取樣，測定亞麻酸含量，分析籽粒中亞麻酸積累動態(tài)，作熒光定量分析。

1.2.2 儀器試劑

Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒SYBR?ExScriptTM RT-PCR Kit、DNA Marker購自天根公司；抗壞血酸購自天津市瑞金特化學品有限公司；DEPC處理水購自上海生工；LightCycler 480系統(tǒng)96孔板、安捷倫N6980氣相色譜儀購自美國安捷倫公司；LightCycler 480 Sealing Foil購自自羅氏診斷公司；電泳瓊脂糖購自西班牙；Light ABI Prism 7500 SDS購自美國；熒光定量PCR儀、低溫冷凍離心機和臺式高速低溫離心機購自Beckman公司；三洋-80℃超低溫冰箱購自日本；-20℃低溫冰箱，超凈工作臺等。

1.2.3 取樣方法

自始粒期R5開始，每7 d取一次樣，幼莢（R5）直至完熟期（R8），取樣10次，每株僅取樣一次，第1~2次取樣對應始粒期，第3~6次取樣對應鼓粒期，第7~8次取樣對應黃熟期，第9~10次取樣對應完熟期。從主莖頂端第二、三個節(jié)位取樣，樣品分兩份，一份于105℃烘箱殺青5 min后，50℃烘箱烘干至恒重，測定籽粒亞麻酸組分含量；另一份樣品莢皮與籽粒迅速分開放入-80℃冰箱保存，提取RNA，作熒光定量分析，檢測已篩選出與亞麻酸代謝相關基因各時期表達量，參照文獻[24-26]方法。

1.2.4 樣品脂肪酸提取及提取方法

各時期待測樣品大豆籽粒，去除雜質(zhì)，每個樣品取5~10粒，粉碎并通過0.25 mm孔徑樣品篩，稱取0.5 g豆粉，加入10 mL離心管中，向離心管中加入5 mL 1%甲醇-氫氧化鈉溶液，斡旋震蕩15 s，充分混勻，靜置30 min。向離心管中滴入5滴10%乙酸，加入3 mL正庚烷，充分震蕩。靜置2 min，吸取上清液，經(jīng)過濾滅菌器過濾，取1.5 mL上機測定。進樣1 μL，乙酸乙酯沖洗微量進樣器。樣品脂肪酸提取方法參照文獻[4]。

1.2.5 樣品脂肪酸測定

研究所用材料RIL群體為大田取樣，群體第7代及親本為盆栽取樣。采用安捷倫N6980氣相色譜儀測定樣本脂肪酸含量，脂肪酸組分數(shù)值計算參照文獻[27-29]方法。

1.2.6 熒光定量分析

1.2.6.1 候選基因篩選與引物設計

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中大豆脂肪酸代謝途徑篩選與脂肪酸代謝相關基因[30-32]，依據(jù)基因注釋及前人報道，選擇與脂肪酸代謝相關基因（見表1）作實時熒光定量分析。篩選出基因設計引物，根據(jù)引物設計原則選擇實時熒光定量PCR引物。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法作相對定量分析，計算過程：分別計算每組ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因，根據(jù)ΔΔCt求出2-ΔΔCt。采用 Light cycler480 羅氏熒光定量儀作實時熒光定量PCR。熒光定量程序；94℃，2 min，94℃、30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，72℃，10 min，38個循環(huán)。

表1 篩選出基因及對應引物Table 1 The screened genes and the corresponding primers

1.2.6.2 待測樣品RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照RNA提取試劑盒說明書操作提取RNA。將各時期待測樣在液氮中研磨后加入1 mL Trizal混勻振蕩，室溫下靜置5 min使樣品RNA與其他物質(zhì)分離，再加入200 μL氯仿渦旋振蕩，充分乳化，使蛋白質(zhì)與RNA分離，室溫靜置5 min后，1 2000 r·min-1， 4 ℃離心15 min，吸上清液600 μL于新管中，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置10 min，使RNA沉淀，12 000 r·min-1，4℃離心10 min后去上清液，加入1 mL 75%乙醇清洗，進一步提純。離心干燥，加入DEPC水溶解RNA。樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA保存，供熒光定量使用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

樣品表型值采用SPASS17.0作統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 代表性群體后代篩選

對2015年收獲180份RIL群體后代作氣相色譜分析，測量后代脂肪酸各組分含量（見表2）。根據(jù)亞麻酸含量結(jié)果篩選JY142與JY182兩份材料作為亞麻酸高值載體，JY20與JY83兩份材料為亞麻酸低值載體作盆栽試驗。

表2 RILL群體后代中亞麻酸高/低值載體篩選結(jié)果Table 2 RILL group of descendants of linolenic acid high/low value carrier screening results

2.2 大豆品籽粒脂肪酸含量積累動態(tài)

由圖1可知，棕櫚酸與硬脂酸在始粒期（R5期）合成，積累量逐漸降低，在鼓粒期（R6期)至完熟期（R8期）積累量降到最低，合成總量基本保持不變；始粒期（R5期）油酸積累量逐漸上升，鼓粒期（R6期）大豆籽粒中油酸組分積累量除合豐25以外持續(xù)上升，其他材料油酸積累量下降，鼓粒后期合豐25積累量與其他材料同時下降，完熟期（R8期）降到最低；亞油酸積累量始粒期（R5期）至完熟期（R8期）一直上升。鼓粒期，合豐25與JY20亞油酸積累量出現(xiàn)波動。始粒期亞麻酸積累量最高，始粒期后逐漸降低，成熟期開始趨于平穩(wěn)，完熟期亞麻酸積累量保持不變，鼓粒期合豐25亞麻酸積累量出現(xiàn)波動，亞麻酸積累量降至最低后再上升，成熟期趨于平穩(wěn)。

2.3 重要候選基因?qū)崟r熒光定量PCR結(jié)果

由圖2可知，基因Glyma.14G194300、Glyma.07G046200、 Glyma.20G245500、 Glyma.13G068600在合豐25、L-5、JY20、JY83、JY142、JY182中，始粒期表達量逐漸增加，始粒期亞麻酸積累量達到最大后開始逐漸下降。鼓粒期基因Glyma.14G194300表達量達到最大后逐漸下降，此時亞麻酸積累量降到最低并趨于平穩(wěn)?；騁lyma.20G158300、 Glyma.07G151300、 Glyma.07G254500在合豐25、JY20、JY83中，始粒期開始表達量逐漸降低或不表達，始粒期亞麻酸積累量達到最大后逐漸下降。鼓粒期基因Glyma.07G151300、Glyma.07G254500表達量開始增加，此時亞麻酸積累量降到最低并趨于平穩(wěn)。

2.4 亞麻酸含量與基因表達量相關性分析結(jié)果

材料各生育期亞麻酸含量與基因表達量相關性分析結(jié)果顯示，基因Glyma.14G194300、Glyma.20G245500表達量與HF25、JY20亞麻酸含量呈正相關，與JY83亞麻酸含量呈負相關，基因 Glyma.20G158300、 Glyma.16G003500、 Glyma.07G151300、Glyma.07G254500 表 達 量 與 HF25、JY20、JY83亞麻酸含量呈負相關，基因Glyma.07G046200、 Glyma.13G068600 表 達 量 與 HF25、JY83亞麻酸含量呈負相關，與JY20亞麻酸含量呈正相關。

圖1 大豆籽粒高/低值載體脂肪酸含量積累動態(tài)曲線Fig.1 Accumulation curves of fatty acids in soybean kernels with high or low values

圖2 實時定量PCR結(jié)果Fig.2 Real time quantitative PCR results

表3 亞麻酸含量與基因表達量相關性分析Table 3 Correlation analysis of linolenic acid content and gene expression

3 討論與結(jié)論

本研究選擇RIL重組自交系親本，成熟時期亞麻酸含量差異較大，其他4種組分含量，基本一致，親本組配群體后代表現(xiàn)較大性狀分離幾率，有助于選擇高油酸且低亞麻酸品系。利用氣相色譜法及實時熒光定量PCR測定大豆籽粒各生育期脂肪酸組分，結(jié)果顯示，大豆籽粒中亞麻酸積累量從始粒期開始迅速上升，進入鼓粒期逐漸降低，成熟期趨于平穩(wěn)直到完熟期保持不變，與徐杰等在大豆籽粒發(fā)育過程中脂肪酸組分積累動態(tài)研究結(jié)果一致[33]。結(jié)果表明，大豆脂肪酸組分含量積累趨勢普遍一致，但亞麻酸積累動態(tài)在鼓粒期表現(xiàn)顯著差異，鼓粒期測定亞麻酸含量可選擇優(yōu)良品系。

大豆籽粒脂肪酸組分積累在各生長發(fā)育期受自然環(huán)境影響，溫度對亞麻酸與棕櫚酸影響較大，莊炳昌等采用人工氣候箱研究表明，夜間溫度升高棕櫚酸含量升高，亞麻酸含量降低[34]。水分與光照對大豆籽粒發(fā)育過程中脂肪酸組分積累影響較大，米景春等研究表明，大豆籽粒脂肪酸組分積累在干旱條件下不同程度降低[35]。劉兵等遮蔭研究表明，大豆生殖生長期遮蔭，影響脂肪酸積累[36]。與前人研究相比，本研究采用室外盆栽，為保證生長條件一致，試驗過程中盆栽以混合均勻等量自然土作營養(yǎng)基質(zhì)，水分等量澆灌，溫度、光照與自然條件相同。與大田相比盆栽可保證土壤均一，營養(yǎng)均衡，避免大田中地力不均影響。水分等量避免極端干旱氣候影響，溫度、光照均為自然條件，避免人為因素影響。

實時定量PCR結(jié)果、亞麻酸含量與基因表達量相關性分析結(jié)果表明，基因Glyma.07G046200、Glyma.20G245500、Glyma.13G068600為明顯雙峰分布，在始粒期與黃熟期出現(xiàn)兩個表達高峰，基因Glyma.16G003500表達呈典型多峰分布，表明在大豆籽粒發(fā)育過程中亞麻酸積累量受多基因調(diào)控，在不同生育期基因表達量對亞麻酸積累量影響不同。基因Glyma.14G194300、Glyma.20G245500在HF25、JY20中對亞麻酸積累量有正調(diào)控作用，在JY83基因?qū)喡樗岱e累量有負調(diào)控作用?；騁lyma.20G158300、Glyma.16G003500、Glyma.07G 151300、Glyma.07G254500 在 HF25、JY20、JY83中對亞麻酸含量有負調(diào)控作用。但大豆始粒期至完熟期亞麻酸含量表達量相對較低，對大豆籽粒亞麻酸積累量影響較小。

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Accumulation dynamics of fatty acid in soybean seed and screening of candidate gene related to linolenic acid metabolism/LI Wenbin,FENG Lei,

SONG Wei,LUO Jian,BI Wenshuang,LIU Yue,XU Lingxiu,ZHAO Xue
(Institute of Soybean Research,Key Laboratory of Soybean Biology in Chinese of Ministry Education,Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding(Genetics)of Agriculture Ministry,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Linolenic acid content,as one of thefive fatty acid components in soybean,is one of the important factors affecting the quality of soybean,its composition and ratio is also directly related to the quality of soybean oil,storage and processing etc.In comparison with other plant oil,soybean oil has better linoleic acid content and linolenic acid ratio.This study analyzed fatty acid content and proportion of'Hefeng 25'(high linolenic acid content of 5.94%varieties,Canada)and stable strains'L-5'(low linolenic acid content of 2.75%varieties),two lines from recombinant inbred lines derived from'Hefeng 25'and'L-5'through gas chromatography method.Additionally,combined with the metabolic pathways of KEGG in soybean fattyacids were screened and unsaturated fatty acid metabolism related candidate genes and screening lines produced during different developmental stages were analyzed by real-time quantitative PCR in'Hefeng 25'and'L-5'expression patterns.The results showed that the same gene in different varieties of linolenic acid content of different regulatory mechanisms,both positive and negative regulations of gene expression regulation in different periods had different degrees of influence on the accumulation of linolenic acid.The results,for exploring the regularity of soybean linolenic acid accumulation and the influence of its candidate genes,for breeding the ideal fatty acid composition and proportion of new soybean varieties,provided theoretical reference.

soybean;fatty acid;gas chromatography;real-time quantitative PCR

S565.1

A

1005-9369（2017）11-0001-08

時間2017-12-6 12:03:11 [URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171206.1203.002.html

李文濱,馮雷,宋偉,等.大豆脂肪酸含量積累動態(tài)及亞麻酸代謝候選基因篩選[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(11):1-8.

Li Wenbin,Feng Lei,Song Wei,et al.Accumulation dynamics of fatty acid in soybean seed and screening of candidate gene related to linolenic acid metabolism[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(11):1-8.(in Chinese with English abstract)

2017-08-27

農(nóng)業(yè)部大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-04-PS04）；國家十二五科技支撐計劃項目（2011BAD35B06）；黑龍江省自然科學基金面上項目（C2015011）；國家自然基金項目（31671717）

李文濱（1958-），教授，博士，博士生導師，研究方向為大豆遺傳育種。E-mail:wenbinli@neau.edu.cn