苦蘵組織培養(yǎng)技術(shù)初探

邱 勝，盧江杰，2，王慧中，2，李 菁，劉玉洋，賀超英

(1． 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036； 2． 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3． 中國科學院植物研究所系統(tǒng)與進化植物學國家重點實驗室，北京 100093)

苦蘵組織培養(yǎng)技術(shù)初探

邱 勝1，盧江杰1，2，王慧中1，2，李 菁3，劉玉洋1，賀超英3

(1． 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036； 2． 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310036； 3． 中國科學院植物研究所系統(tǒng)與進化植物學國家重點實驗室，北京 100093)

為建立藥用植物苦蘵穩(wěn)定高效的組織培養(yǎng)體系，以苦蘵的子葉為外植體進行離體培養(yǎng)，對培養(yǎng)條件進行探索和優(yōu)化.結(jié)果表明：苦蘵種子在1/2 MS培養(yǎng)基中萌發(fā)可培養(yǎng)出適于后續(xù)試驗的健康子葉；誘導愈傷組織和不定芽的最佳培養(yǎng)基為含6-BA(3 mg/L)和NAA(0.05 mg/L)的MS培養(yǎng)基，其愈傷組織誘導率達100%，從愈傷組織誘導不定芽率最高達78%；將生長良好的2～3 cm的不定芽接種到1/2 MS生根培養(yǎng)基中，兩周左右可形成較好的根系，生根率可達100%.

苦蘵；子葉；組織培養(yǎng)；植株再生；最佳培養(yǎng)基

苦蘵(PhysalisangulataL.)為茄科酸漿屬一年生草本植物，分布于華東、華中、華南及西南，印度、越南、日本、澳大利亞和美洲均有產(chǎn)[1].苦蘵以果、根或全草入藥，性味苦、寒，主治咽喉腫痛、腮腺炎、急慢性氣管炎、肺膿瘍、痢疾、小便不利、外用治膿泡瘡等.苦蘵主要含有醉茄內(nèi)酯、酸漿苦素、黃酮、生物堿及甾醇等化學成分[2-3]，其中酸漿苦素和谷甾醇具有多種體內(nèi)外的抗癌活性，對于宮頸癌和皮膚癌都具有明顯療效[4].

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是當今生物工程中的一個重要組成部分，已得到廣泛應(yīng)用.苦蘵作為一種藥用植物，具有潛在抗癌效果，而且還具有生長周期短、單株種子多、近緣物種(番茄、馬鈴薯、辣椒和茄子)參考基因組多等特點，便于進行遺傳轉(zhuǎn)化和基因功能研究，在作為藥用植物基因工程受體模式植物方面具有廣闊的前景.目前，關(guān)于苦蘵的研究主要集中在有效成分分析及藥理研究方面[5-7].雖然同屬植物酸漿和毛酸漿的組織培養(yǎng)研究較多[8-10]，但對苦蘵組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究和應(yīng)用微乎其微[11].本試驗以苦蘵幼苗子葉為外植體，對離體培養(yǎng)條件進行探索和優(yōu)化，以期為苦蘵的快速繁殖、優(yōu)良種質(zhì)資源保護和新品種選育奠定基礎(chǔ)，同時為苦蘵遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建、抗腫瘤活性成分及其代謝途徑相關(guān)的基因功能驗證和利用提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室收集的浙江浦江野生種源，種植在杭州師范大學下沙校區(qū)試驗地.取苦蘵成熟果實后剝開，洗出種子，硅膠干燥并保存于實驗室4 ℃冰箱備用.

1.2 培養(yǎng)基

種子萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2 MS培養(yǎng)基；誘導愈傷培養(yǎng)基：含NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基，pH為5.8，根據(jù)試驗設(shè)計要求在培養(yǎng)基中添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑；生根培養(yǎng)基：1/2 MS培養(yǎng)基，含NAA 0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基和含NAA 0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基.

配制每升MS基本培養(yǎng)基需加4.74 g MS培養(yǎng)基干粉(鼎國，北京)，30 g蔗糖，一定濃度的6-BA和NAA，定容至1 L后調(diào)pH至5.8～6.0，加8 g瓊脂粉(終質(zhì)量分數(shù)0.8%)，然后高壓滅菌(121 ℃，20 min)，待培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時，倒板，備用.

1.3 種子萌發(fā)

選取顆粒飽滿的種子進行試驗.種子在95%乙醇中搖晃浸泡5 min.再加入20%(體積分數(shù))次氯酸鈉，0.1%(體積分數(shù))吐溫20，繼續(xù)浸泡20 min.倒凈液體后，用無菌的ddH2O清洗種子3～5次.將種子均勻播種在含1/2 MS培養(yǎng)基的玻璃培養(yǎng)皿上，用Parafilm膜封口后置于培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)2周左右，待長出真葉，獲得無菌苗，用于后續(xù)實驗.

1.4 最適生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的篩選

選取苦蘵種子萌發(fā)2周時的幼苗子葉為外植體.剪去子葉兩端，接種于誘導分化培養(yǎng)基上.在基本培養(yǎng)基中添加不同配比的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：細胞分裂素6-BA(0～3.0 mg/L)和生長素NAA(0～0.2 mg/L).共設(shè)10個組合，每組合3個重復，每重復接種30個葉盤.培養(yǎng)條件同上.40 d后統(tǒng)計愈傷組織和不定芽誘導率：

愈傷組織誘導率/%=誘導出愈傷的葉盤數(shù)/接種的葉盤數(shù)×100；

不定芽出芽率/%=長出芽的愈傷數(shù)/接種的愈傷數(shù)×100.

1.5 生根培養(yǎng)及移栽

待愈傷上的不定芽長到2～3 cm時，剪下小苗，將其插入生根培養(yǎng)基中.繼續(xù)培養(yǎng)，待小苗長出白色且粗壯的根后，進行馴化移栽.首先在培養(yǎng)室將瓶蓋打開煉苗2～3 d，然后取出植株，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽.移栽條件：營養(yǎng)花卉土∶蛭石=3∶1，光照培養(yǎng)箱，16 h 光照，26 ℃.

2 結(jié)果與分析

表1 不同生長調(diào)節(jié)劑濃度配比對苦蘵子葉不定芽分化的影響Tab.1 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA in shoots-inducing medium on the induction of shoots from P. angulate cotyledon

注：10個組合均以MS為基本培養(yǎng)基；不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05).

2.1 苦蘵種子的萌發(fā)

苦蘵種子在自然條件下播種發(fā)芽率較低，但在組織培養(yǎng)環(huán)境下萌發(fā)率極高.在1/2 MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，種子的胚根開始出現(xiàn).如圖1B所示，2周后，絕大多數(shù)幼苗已形成子葉，并長出較為發(fā)達的根系，可用于后續(xù)試驗.

2.2 最適生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的篩選

如表1所示，采用10種不同培養(yǎng)基組分對苦蘵的植株再生能力進行研究.培養(yǎng)1周左右后，葉盤開始加厚.約3周后，愈傷組織上有芽開始萌發(fā)(圖1D).當MS基本培養(yǎng)基中不添加任何生長調(diào)節(jié)劑時(表1中編號1，即試驗對照組)，葉盤誘導愈傷組織的生長狀態(tài)差，一周左右葉盤周圍仍未見有須根長出，誘導率為0.當6-BA質(zhì)量濃度為3 mg/L、NAA為0.05 mg/L(編號8)時，不定芽誘導率達到77.78%，高于6-BA 3 mg/L、NAA 0.1 mg/L(編號9)時不定芽的誘導率73.33%； 6-BA為2 mg/L、NAA為0.2 mg/L(編號7)時，不定芽誘導率為66.67%；而6-BA為3 mg/L、NAA為0.2 mg/L(編號10)時，不定芽誘導率為62.22%；其他處理條件下的出芽率均低于50%.可見，合適濃度的6-BA和NAA對不定芽的誘導起著關(guān)鍵作用，不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑在一定程度上影響不定芽的數(shù)量和質(zhì)量.因此，本研究中苦蘵再生的最佳培養(yǎng)基為：含6-BA 3 mg/L和NAA 0.05 mg/L的MS培養(yǎng)基.

2.3 生根培養(yǎng)及移栽

如圖1F所示，培養(yǎng)兩周后，1/2 MS培養(yǎng)基中不定芽生根率達100%，根的生長狀態(tài)較好，主根系和須根分明.含NAA 0.1 mg/L和0.2 mg/L的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)材料的周圍長出較密的1～3 cm須根，呈輻射狀.低鹽的培養(yǎng)基有利于生根培養(yǎng)，這與一般植物生根培養(yǎng)時需要低鹽濃度培養(yǎng)基的結(jié)論[12]一致.1/2 MS及含有0.1 mg/L NAA的1/2 MS兩種培養(yǎng)基中的植株，移栽后成活率均較高，但1/2 MS中的植株由于根系較為發(fā)達，植物長勢較快.因此，本研究中苦蘵生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS.

2.4 移栽幼苗的生長情況

移栽具有發(fā)達健壯根系的幼苗到混勻的花土和蛭石(2∶1)無菌基質(zhì)中培養(yǎng)，其成活率可達98%以上；出瓶一周后可達10片葉子以上(圖1G)，3～4周后能開花，并陸續(xù)結(jié)果(圖1H，1I).

A: 苦蘵種子0 d；B: 苦蘵2周的小苗；C: 葉盤0 d；D: 葉盤21 d；E: 葉盤32 d；F: 芽生根培養(yǎng)12 d； G: 出瓶后1周的幼苗；H: 苦蘵組織培養(yǎng)成熟植株；I: 組織培養(yǎng)成熟植株的花與果.圖中標尺為1 cm.圖1 苦蘵組織培養(yǎng)體系不同階段Fig. 1 Different stages of tissue culture for Physalis angulata L.

3 討論

3.1 選擇合適的種子消毒方法

由于取材時苦蘵種子表面帶菌，為了獲得實驗所需的無菌苗，種子萌發(fā)前需進行消毒.消毒的關(guān)鍵是選擇合適的消毒劑及其濃度和消毒時間.消毒劑殺滅種子表面微生物的同時，也會對外植體產(chǎn)生一定的傷害.唐琳等[13]指出，經(jīng)0.1%升汞和3%～4%次氯酸鈉溶液分別消毒后的番茄種子在最先出芽時間、子葉形成時間及全部出芽時間上均有極顯著差異，番茄種子消毒以3%～4%次氯酸鈉溶液最佳.本試驗中苦蘵種子在95%乙醇中搖晃浸泡5 min；再加入20%乙醇體積的次氯酸鈉和0.1%乙醇體積的吐溫20，繼續(xù)浸泡20 min.倒凈液體后，用無菌的ddH2O清洗種子3～5次，消毒效果較好.這說明不同培養(yǎng)材料消毒方法有差異.

3.2 苦蘵組織培養(yǎng)中外植體的選擇

最佳外植體是組織培養(yǎng)成功的一個關(guān)鍵因素，外植體的年齡、發(fā)育階段、生長環(huán)境，選取部位和時間都可能導致外植體生理、生化狀態(tài)的差異，從而影響植物組織培養(yǎng)的效果.一般來說，與由成熟的及高度分化的細胞組成的器官相比，分化程度較輕的細胞組成的器官具有較高的再生能力.據(jù)報道，酸漿屬植物的成熟葉盤、下胚軸、上胚軸、葉片基部、子葉及根尖等的切片均可用于愈傷組織的誘導[13]，如：粘果酸漿(P.ixocarpa)以根尖為外植體誘導出愈傷組織[14]；秘魯酸漿(P.peruviana)以葉片為外植體進行體外再生體系的研究[15]；陳明波等[8]在以酸漿(P.alkekengi)的葉片、葉柄、莖段、子葉、胚軸、胚根為外植體進行離體培養(yǎng)的研究中，發(fā)現(xiàn)葉柄為酸漿不定芽分化的最佳外植體類型；以通肯酸漿(P.tungkenensis)無菌苗的子葉為外植體進行組織培養(yǎng)和植株再生的研究中，愈傷組織率、分化率最高達85%，且能形成大量健壯的不定芽，有利于快速繁殖[10]；以毛酸漿(P.pubescens)無菌苗的子葉為外植體也能誘導出再生植株[9].比較已有的文獻，在酸漿屬植物組織培養(yǎng)中，子葉經(jīng)常作為外植體使用，而且愈傷和分化的頻率較高.因此，本試驗中直接選擇苦蘵無菌苗的子葉為外植體進行研究.1周左右葉盤開始加厚，進一步培養(yǎng)3周左右，愈傷組織表面開始分化出綠色芽點，并進一步發(fā)育形成不定芽，誘導率最高接近78%.可見，苦蘵無菌苗的子葉適宜作為外植體進行組織培養(yǎng)繁殖.

3.3 苦蘵組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)劑的作用

植物生長調(diào)節(jié)劑中的細胞分裂素和生長素類物質(zhì)在植物的再生和誘導愈傷組織形成的過程中具有重要的作用.細胞分裂素類具有促進細胞分裂和分化、誘導芽的形成和生長以及顯著改變其他內(nèi)源激素作用等特點.生長素類物質(zhì)則在愈傷組織的誘導、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根方面有重要作用.然而兩者比例是關(guān)鍵.

本研究中，當MS培養(yǎng)基中不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑時，苦蘵子葉葉盤不增厚，無法形成愈傷，一周后在葉盤周圍長出許多須根.而其他9組高濃度6-BA和低濃度NAA配比組合的培養(yǎng)基中，均能由子葉葉盤成功誘導出愈傷組織，誘導率為100%.但不同的生長調(diào)節(jié)劑組合，愈傷組織的出芽率存在明顯差異.如表1所示，當6-BA為1 mg/L和2 mg/L時，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織的出芽率升高.而當6-BA為3 mg/L時，隨著NAA濃度的升高，愈傷組織的出芽率反而有所降低.由此可見，合適的生長調(diào)節(jié)劑濃度配比相當重要，為達到最高的出芽率，最適的生長調(diào)節(jié)劑配比為：3 mg/L 6-BA加0.05 mg/L NAA.這樣在一個培養(yǎng)基上就可以完成常規(guī)的愈傷誘導和不定芽誘導兩個步驟，不但能保證較高的不定芽誘導率，而且縮短了實驗周期，減少了污染率.

苦蘵植株的生根較容易，不需要額外的生長調(diào)節(jié)劑，在普通的1/2 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周左右即可形成較好的根系.所以其生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基.

至此，苦蘵的高效、快速組織培養(yǎng)體系已建成.

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TissueCultureSystemforPhysalisAngulataL.

QIU Sheng1, LU Jiangjie1, 2, WANG Huizhong1, 2, LI Jing3, LIU Yuyang1, HE Chaoying3

(1. College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China; 2. Zhejiang Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement and Quality Control of Medicinal Plants, Hangzhou 310036, China; 3. State Key Laboratory of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany-Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China)

In order to establish a stable and effective tissue culture system inPhysalisangulateL., in vitro culture of the cotyledons ofP.angulatewas made, and the culture conditions were explored and optimized. The results showed that the seeds ofP.angulatecould culture healthy cotyledons which were fit for the follow-up tests in 1/2 MS culture medium; the callus induction rate reached 100% and the adventitious bud rate reached 78% within the best culture medium of induced callus and adventitious buds, which contained MS 6-BA 3 mg/L, NAA 0.05 mg/L. The powerful rooting rate of regenerated plants was up to 100% when 2～3 cm well-grown adventitious bud was inoculated into 1/2 MS rooting medium within a period of two weeks.

PhysalisangulataL.; cotyledon; tissue culture; plant regeneration；optimum medium

2017-05-19

國家自然科學基金項目(31470407)；浙江省公益技術(shù)計劃項目(2014C32090).

盧江杰(1982-)，男，講師，博士，主要從事藥用植物分子生物學研究.E-mail:lujj@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.06.008

Q94

A

1674-232X(2017)06-0613-05