兔眼藍(lán)莓初代培養(yǎng)的建立

郭麗鄭志新武延生

（1邢臺學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院河北邢臺054001；2河北北方學(xué)院園藝系河北張家口075000）

兔眼藍(lán)莓初代培養(yǎng)的建立

郭麗1鄭志新2武延生1

（1邢臺學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院河北邢臺054001；2河北北方學(xué)院園藝系河北張家口075000）

以兔眼藍(lán)莓栽培品種‘北陸’當(dāng)年生帶腋芽的莖段為試材，探討其初代培養(yǎng)過程中消毒時間和生長調(diào)節(jié)劑配比濃度對芽誘導(dǎo)率的影響。試驗結(jié)果表明：兔眼藍(lán)莓莖段最佳消毒時間是以70%酒精處理30s與0.1%升汞處理8min，以MS+6–BA 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+ZT 2.0mg/L為培養(yǎng)基的芽誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率可達(dá)79.0%。

兔眼藍(lán)莓；初代培養(yǎng)；消毒時間；生長調(diào)節(jié)劑

藍(lán)莓，學(xué)名越橘(Vaccinium vitis–idaea)，屬杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)，多年生落葉或常綠矮小灌木，原產(chǎn)于北美[1]。目前生產(chǎn)栽培的主要品種分為三大類：高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓。兔眼藍(lán)莓是從野生兔眼越橘類中選育出的栽培品種，由于果實在未成熟前顏色如兔眼一般紅，所以取名為兔眼藍(lán)莓[2]。

藍(lán)莓果實酸甜可口，具有獨特的營養(yǎng)保健功能，因含有較多的花色苷、黃酮等生理活性物質(zhì)，具有改善視力、延緩腦神經(jīng)衰老、防止心血管疾病、提高人體免疫力等功效，是世界糧農(nóng)組織推薦的五大健康水果之一[3,4]。藍(lán)莓的常規(guī)繁殖方法速度較慢、繁殖規(guī)模受到阻礙且苗木在生長勢、果實品質(zhì)等諸多方面存在不足。為滿足市場需要，迅速擴(kuò)大藍(lán)莓的生產(chǎn)規(guī)模，采用組培法能在較短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)苗木。

1 材料與方法

1.1 材料。供試材料為兔眼藍(lán)莓栽培品種‘北陸’的當(dāng)年生帶腋芽的莖段，取自河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院溫室。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒處理與接種。將采回的外植體用剪刀剪成約2cm長的莖條，去除葉片，保留腋芽，用洗衣粉水浸泡30min后，再用流水沖洗2h，然后在超凈工作臺上進(jìn)行消毒處理[5]。先用70%酒精浸泡30s，用無菌水沖洗2～3次，再在0.1%升汞中浸泡，設(shè)定浸泡時間為4min、6min、8min、10min，無菌水沖洗5次，然后將材料放于無菌濾紙上吸干水分。切去莖條上下兩端的傷口部分，將其剪成0.5～1cm的單芽莖段，接種于培養(yǎng)基上[3]。每個處理接種10瓶，每瓶3～4個外植體，3次重復(fù)。所用基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，添加瓊脂6g/L，蔗糖30g/L，pH值為5.6～5.8。

1.2.2 培養(yǎng)條件。接種的莖段置于25±2℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2000lx，每日持續(xù)光照16h，14d后統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體滅菌效果的影響。在消毒處理中分別用0.1%升汞浸泡4min、6min、8min和10min。接種14d后污染率和死亡率結(jié)果見表1。處理A的污染率最高，達(dá)到73.3%，由于消毒時間短，導(dǎo)致消毒不夠徹底，還存在大量雜菌，消毒效果不理想；隨著消毒時間逐漸延長，處理B、C、D的污染率分別降至46.7%、26.7%、13.4%，處理B與處理C、D差異顯著，處理C與處理D差異不顯著。同時，隨著消毒時間逐漸延長，死亡率也呈遞增的趨勢，分別為10%、16.7%、23.4%、43.4%，處理D與處理A、B、C存在顯著性差異，說明0.1%升汞是強(qiáng)消毒劑，隨著消毒時間的延長，對外植體細(xì)胞的傷害程度也會增大，從而導(dǎo)致外值體死亡；處理C與處理D比較，污染率相差不大，且處理D比處理C的污染率要高，所以處理C最合適。綜上所述，處理C的污染率、褐變與死亡率均在可接受范圍內(nèi)，在一定程度上既消滅了雜菌又不至于對外植體產(chǎn)生較大毒害，所以用0.1%升汞處理外植體8min較好。

表1 不同滅菌時間對外植體污染率和死亡率比較

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比濃度對芽誘導(dǎo)的影響。將沒有受污染和死亡的兔眼藍(lán)莓莖段轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，所設(shè)培養(yǎng)基配方及誘導(dǎo)結(jié)果見表2。由表2可知，以6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L的培養(yǎng)基對芽誘導(dǎo)效果最好，達(dá)到79.0%。在BA和IBA一定時，隨著ZA的濃度不斷增加，芽誘導(dǎo)率先增加，然后降低。當(dāng)ZT為2.0mg/L時，芽誘導(dǎo)率最高；當(dāng)ZT為3.0mg/L時，芽誘導(dǎo)率下降到70.2%?？梢?，低濃度的ZA對芽誘導(dǎo)起到了促進(jìn)作用，隨著ZA濃度升高，芽誘導(dǎo)效果降低，高濃度ZA對芽誘導(dǎo)具有抑制作用。試驗結(jié)果表明，最適宜的兔眼藍(lán)莓芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L。

表2 不同生長調(diào)節(jié)劑配比濃度對芽誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論。采于溫室中的試驗材料，很容易粘附細(xì)菌和真菌等。在組織培養(yǎng)中，外植體的消毒效果直接關(guān)系到后續(xù)芽誘導(dǎo)的效果及組培苗的成活率，確定最佳的消毒方式與時間不可或缺。本試驗通過研究消毒時間的長短，篩選出以兔眼藍(lán)莓莖段為外植體的最佳消毒方法為：70%酒精浸泡30s后0.1%升汞浸泡8min。同時，添加一定濃度的生長素和細(xì)胞分裂素對于誘導(dǎo)兔眼藍(lán)莓的芽具有明顯的促進(jìn)作用。在兔眼藍(lán)莓初代培養(yǎng)的過程中，以MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L為培養(yǎng)基配方的芽誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率達(dá)到79.0%。

3.2 討論。菌類污染是植物組織培養(yǎng)中較為常見的問題，使用的消毒劑既要能夠把外植體表面的雜菌殺死，又必須容易被無菌水從外植體上沖洗干凈而不至于對外植體本身產(chǎn)生較大的毒害作用進(jìn)而影響其正常生長[5]。0.1%升汞是組織培養(yǎng)中常用的強(qiáng)消毒劑，且較難除去殘留，具有很強(qiáng)的穿透力和殺傷力，容易殺死和損傷細(xì)胞，造成外植體的死亡，但其消毒效果也比較明顯。因此在使用時，應(yīng)當(dāng)控制好消毒的具體時間，用后要以大量的無菌水多次沖洗，在降低污染率的同時，還要盡可能減少消毒劑對外植體的傷害。所以，篩選準(zhǔn)確的消毒時間對后續(xù)工作有至關(guān)重要的作用。

植物分化是一個復(fù)雜的生理生化過程，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度及組合對不定芽的誘導(dǎo)有極其關(guān)鍵的作用。在植物組織培養(yǎng)過程中，愈傷組織的誘導(dǎo)、芽苗的生長受生長素和細(xì)胞分裂素的調(diào)控。細(xì)胞分裂素能誘導(dǎo)不定芽的形成，削弱頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽分化和生長；生長素能促進(jìn)細(xì)胞伸長，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生特別是當(dāng)二者有效結(jié)合時，能更強(qiáng)烈地刺激愈傷組織的形成[6]。本試驗中，單獨添加6-BA與IBA的誘導(dǎo)效果較一般，當(dāng)添加ZT后，芽誘導(dǎo)率得到有效提高，可見ZT是植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因素[7]。同時，采用不同的6-BA、IBA與ZT配比濃度，芽誘導(dǎo)的效果也存在差異。試驗表明，當(dāng)使用6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+ZT 2.0mg/L的植物生長調(diào)節(jié)劑配比時，芽誘導(dǎo)率得到顯著提高，達(dá)到79.0%。

本試驗對兔眼藍(lán)莓的初代培養(yǎng)進(jìn)行了研究，確定了外植體的最佳消毒方法。通過在MS基本培養(yǎng)基上添加不同濃度的BA、IBA和ZA來比較芽誘導(dǎo)的效果，但其它種類和濃度的生長素和細(xì)胞分裂素以及不同種類的基本培養(yǎng)基對于兔眼藍(lán)莓初代培養(yǎng)的影響和作用還需要進(jìn)一步深入的研究。

[1]宋剛，徐銀，宋金耀，等.不同因素對高叢越橘葉片初代培養(yǎng)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(4)：44～45.

[2]茨韋特科夫·約旦，楊帆，趙燕麗，等.引進(jìn)國外藍(lán)莓品種的組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(6)：6～8.

[3]孫書偉.藍(lán)莓組培苗瓶內(nèi)生根的探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(4)：786～788.

[4]陳愛美，李凌，曾明.影響兔眼越橘初代培養(yǎng)的因素分析[J].生物技術(shù)，2004，14(4)：61.

[5]鄭偉尉，呂錫山，慎家輝，等.兔眼藍(lán)莓“園藍(lán)”離體培養(yǎng)增殖技術(shù)研究[J].中國南方果樹，2013，42(1)：89～91.

[6]鄭春明.植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，2011.

[7]李杰，王明瑩，黃學(xué)文，等.不同玉米素濃度對藍(lán)莓莖段芽誘導(dǎo)的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013(2)：85～89.