彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MYC和BCL-2蛋白共表達(dá)的臨床病理意義

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(1.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院病理科，廣東 廣州510800；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科)

·臨床醫(yī)學(xué)·

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MYC和BCL-2蛋白共表達(dá)的臨床病理意義

胡名娟1*，李國偉1，歐陽小明2

(1.廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院病理科，廣東 廣州510800；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科)

目的檢測彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)中MYC和BCL-2蛋白表達(dá)狀況，探討MYC/BCL-2共表達(dá)在DLBCL中的臨床意義和預(yù)后評估價值。方法回顧性分析76例確診并采用利妥昔單抗初治的非特指型DLBCL病例的Ann Arbor分期、標(biāo)準(zhǔn)國際預(yù)后指數(shù)評分(IPI)、免疫組化Hans分型和臨床療效等臨床病理參數(shù)，采用免疫組化EnVision二步法檢測MYC和BCL-2蛋白表達(dá)狀態(tài)，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果76例DLBCL組織中，MYC陽性表達(dá)55例(72.4%)，BCL-2陽性表達(dá)41例(53.9%)，MYC與BCL-2共表達(dá)者33例(43.4%)。MYC/BCL-2共表達(dá)者Ann Arbor分期中高分期者比例顯著增高，且臨床治療未緩解者明顯增多(P<0.05)。但與Hans分型和原發(fā)部位等因素均無相關(guān)性。標(biāo)準(zhǔn)IPI評分與DLBCL所有臨床病理特征均無聯(lián)系。結(jié)論MYC/BCL-2共表達(dá)可能是DLBCL的特殊免疫組化表型，作為標(biāo)準(zhǔn)IPI預(yù)后評分的補(bǔ)充，對利妥昔單抗初治DLBCL患者預(yù)后判斷具有一定價值。

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤； MYC蛋白； BCL-2蛋白； 預(yù)后

彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤類型，由于存在組織學(xué)亞型、免疫表型和遺傳學(xué)基因表型的差異，DLBCL在臨床病理特征和預(yù)后等方面都表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性[1]。最近，“雙打擊”B細(xì)胞淋巴瘤(double-hit lymphoma)逐漸被臨床和研究者重視，這是一種MYC和 BCL-2或BCL-6基因重排的特殊表型，可發(fā)生于6%～13%的B細(xì)胞淋巴瘤中[2-3]，但MYC和BCL-2蛋白在腫瘤中的“共表達(dá)”卻高達(dá)29%～45%[4]，而這一特殊免疫表型與DLBCL的臨床預(yù)后關(guān)系尚不完全明確。本文即通過免疫組化法檢測MYC和BCL-2蛋白的共表達(dá)狀態(tài)，并與患者的臨床病理學(xué)特征相聯(lián)系，探討MYC/BCL-2共表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本收集收集2013年1月～2016年6月廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科收治有明確診斷的非特指型DLBCL(DLBCL,NOS)標(biāo)本76例，所有病例均由2位病理醫(yī)師根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷[1]或回顧性復(fù)習(xí)閱片，均獲得相同的診斷結(jié)果。所有患者均經(jīng)R-CHOP方案作為初治方案，以Ann Arbor分期為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)國際預(yù)后指數(shù)(the international prognostic index score，IPI)評分。所有患者均經(jīng)知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理會審核批準(zhǔn)。

1.2一般資料收集的76例非特指型DLBCL病例中男性44例，女性32例，年齡22～68歲，中位年齡53歲，大于60歲患者44例(57.9%)，小于60歲患者32例(42.1%)。53例患者(69.8%)原發(fā)于淋巴結(jié)內(nèi)；23例原發(fā)于淋巴結(jié)外(30.2%)，其中1例原發(fā)于骨，甲狀腺1例，16例原發(fā)于胃腸道，2例原發(fā)于睪丸，1例原發(fā)于卵巢，2例原發(fā)于皮膚。Ann Arbor分期I～I(xiàn)I期者27例(35.5%)，III～I(xiàn)V期者49例(64.5%)。IPI評分1～2分(低危險度)者28例(36.8%)，3～5分(中—高危險度)者48例(63.2%)。Hans分型GCB型31例(40.8%)，non-GCB型45例(59.2%)。

1.3免疫組織化學(xué)染色及評判標(biāo)準(zhǔn)所有石蠟包埋病理標(biāo)本均經(jīng)4%中性福爾馬林固定，常規(guī)HE染色組織學(xué)觀察。采用EnVision 二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。檢測標(biāo)記物包括：MYC、BCL-2、CD10、BCL-6、MUM-1和Ki-67。第一抗體均購自Dako公司和福州邁新公司。4 μm厚度切片經(jīng)脫蠟水化和抗原修復(fù)后，滴加一抗，放入37 ℃水浴箱孵育 60 min，PBS沖洗后按照采用EnVision檢測試劑盒說明書進(jìn)行，室溫孵育 30 min，再次PBS 沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，然后脫水、透明、封片，每例均設(shè)陽性和陰性對照。MYC、BCL-6和Ki-67表達(dá)于細(xì)胞核，BCL-2和CD10表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。所有染色切片均由2位病理醫(yī)師雙盲法閱片，每張切片計數(shù)≥500個細(xì)胞。MYC陽性細(xì)胞比例≥50%、BCL-2陽性細(xì)胞比例≥30%判斷為陽性表達(dá)[5]；CD10、BCL-6和MUM-1染色結(jié)果用于DLBCL的Hans分型，陽性細(xì)胞比例≥30%判斷為染色陽性[6]。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析采用 SPSS 14.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MYC和BCL-2在DLBCL組織中表達(dá)76例DLBCL組織中，MYC陽性表達(dá)55例(72.4%)(圖1C)，BCL-2陽性表達(dá)41例(53.9%)(圖1D)，MYC與BCL-2共表達(dá)者33例(43.4%)。表1顯示了MYC/BCL-2共表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。MYC/BCL-2共表達(dá)者Ann Arbor分期中高分期者比例顯著增高，且臨床治療未緩解者明顯增多，差異均具有顯著性(P<0.05)。Hans分型中non-GCB型比例略有增多，但差異無顯著性(P=0.101)。年齡、性別以及原發(fā)部位等臨床病理特征因素中差異均無顯著性。

圖1 CD20、MYC、BCL2在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)(免疫組化Envision二步法， ×400)A：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤HE染色；B：CD20在瘤細(xì)胞膜的表達(dá)；C：MYC在瘤細(xì)胞核的表達(dá)；D：BCL2在瘤細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)

例數(shù)MYC/BCL-2共表達(dá)非MYC/BCL-2共表達(dá)χ2值P值性別 男性4419250.0020.961 女性321418年齡(歲) ≥604417270.9730.324 <60321616IPI評分 低危險度2813150.1630.686 中—高危險度482028AnnArbor分期 Ⅰ～Ⅱ期2717106.5100.011 Ⅲ～Ⅳ期491633Ki-67指數(shù) ≥70%4518270.5260.468 <70%311516Hans分型 GCB型3110212.6920.101 Non-GCB型452322原發(fā)部位 淋巴結(jié)內(nèi)5320332.3040.129 淋巴結(jié)外231310臨床治療 未完全緩解2919109.3200.002 已完全緩解471433

2.2標(biāo)準(zhǔn)IPI評分與其它臨床病理特征之間的聯(lián)系為了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)IPI在利妥昔單抗治療患者中的預(yù)后評估作用，本研究分析了標(biāo)準(zhǔn)IPI與DLBCL患者的臨床病理特征。結(jié)果如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)IPI評分與DLBCL患者的主要臨床病理特征指標(biāo)均無相關(guān)性(P>0.05)。提示標(biāo)準(zhǔn)IPI評分對于利妥昔單抗治療DLBCL患者的預(yù)后評估作用有限。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)IPI評分與利妥昔單抗初治DLBCL患者的臨床病理特征關(guān)系

3 討 論

目前DLBCL生物學(xué)行為高度異質(zhì)性和臨床預(yù)后評估指標(biāo)還尚未確定。標(biāo)準(zhǔn)國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評分由于綜合了年齡、侵犯部位、疾病進(jìn)展程度和腫瘤負(fù)荷等多項(xiàng)臨床病理參數(shù)，一直認(rèn)為是較好的DLBCL預(yù)后指標(biāo)之一[7]。但臨床采用利妥昔單抗(美羅華)后，標(biāo)準(zhǔn)IPI各分組之間的預(yù)后差異變小，不能很好地用于評估DLBCL患者預(yù)后，故對標(biāo)準(zhǔn)IPI評分進(jìn)行修訂，產(chǎn)生修訂版IPI評分和NCCN-IPI評分[8]。本研究結(jié)果也表明，標(biāo)準(zhǔn)IPI評分確實(shí)不能影響利妥昔單抗治療患者的緩解率。盡管由于缺乏確切的隨訪資料未能對患者進(jìn)行1年和3年生存率比較，本研究結(jié)果仍提示標(biāo)準(zhǔn)IPI評分對臨床療效的預(yù)測作用并不理想，可能需要更多、更精確的預(yù)后參數(shù)參與評估。

“雙打擊”淋巴瘤(DHL)傳統(tǒng)上是指同時存在MYC/8q24及其他基因位點(diǎn)易位的B細(xì)胞淋巴瘤，最常見的是BCL-2/18q21，但也是較少見BCL-6、CCND1和BACH2等基因[9]。由于MYC、BCL-2等基因異常影響DLBCL生物學(xué)行為，表現(xiàn)為患者預(yù)后極差，一線方案療效有限和生存期明顯縮短，故“雙打擊”淋巴瘤成為近年的研究熱點(diǎn)。但是，通過基因方法檢測遺傳學(xué)“雙打擊”DLBCL在臨床實(shí)踐中的檢出率并不高，只有約6%～13%[2-3]，而MYC/BCL-2共表達(dá)卻可在29%～45%的病例中檢出[4]。同時，對于一些缺乏基因檢測方法的基層醫(yī)院，免疫組化檢測MYC/BCL-2共表達(dá)的方法更方便快捷，而且已有研究顯示，MYC/BCL-2共表達(dá)的DLBCL患者預(yù)后較差[10]，而MYC/BCL-2非共表達(dá)者的總生存時間及無進(jìn)展生存期延長[11]。因此，MYC/BCL-2的免疫組化檢測對DLBCL患者的預(yù)后具有判斷價值，也可能作為預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。Green等[2]通過免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)MYC/BCL-2共表達(dá)者治療后完全緩解率降低，3年生存期及無進(jìn)展生存期均短于非共表達(dá)患者。因此提出“免疫組化雙打擊評分(Immunohistochemical double-hit score)”作為現(xiàn)行利妥昔單抗治療DLBCL的預(yù)后補(bǔ)充評分體系，以發(fā)現(xiàn)那些療效差和預(yù)后不良的病例。本研究結(jié)果顯示MYC/BCL-2共表達(dá)比例為43.4%，且共表達(dá)者臨床治療完全緩解率低，與既往研究結(jié)果基本一致。本研究還顯示，MYC/BCL-2共表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)IPI評分并無相關(guān)性。提示MYC/BCL-2共表達(dá)可能是獨(dú)立于標(biāo)準(zhǔn)IPI評分之外的因素之一，它影響DLBCL預(yù)后并不依賴于腫瘤IPI評分特征。但是否能夠作為DLBCL的獨(dú)立影響因素則尚需要進(jìn)一步研究明確，因?yàn)橐延醒芯匡@示仍有相當(dāng)數(shù)量的“非MYC/BCL-2共表達(dá)”患者通過標(biāo)準(zhǔn)R-CHOP方案能夠達(dá)到滿意療效[12]，說明目前臨床尚不能根據(jù)瘤細(xì)胞MYC/BCL-2共表達(dá)狀況即對初治DLBCL調(diào)整為強(qiáng)度更大的治療方案(如García-Suárez J等[13]EDOCH-R-2周方案)。

有研究顯示MYC高表達(dá)與患者IPI評分存在相關(guān)性，提示MYC高表達(dá)是患者預(yù)后變差的標(biāo)志之一[11]。但本研究結(jié)果并未得出這一結(jié)論，相似地國內(nèi)楊海燕等[14]單因素生存分析也未發(fā)現(xiàn)MYC基因異常對患者整體生存有明顯影響。由于MYC基因編碼轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等多個過程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，利妥昔單抗的應(yīng)用并不能克服這一不良因素[4]，而諸多研究均顯示標(biāo)準(zhǔn)IPI評分在利妥昔單抗治療DLBCL患者的評估局限性[8]，故MYC/BCL-2共表達(dá)免疫組化表型可能代表一種DLBCL的特殊臨床表型，其背后潛在的腫瘤細(xì)胞增殖、分化、黏附、侵襲等分子機(jī)制并非標(biāo)準(zhǔn)IPI評分能夠完全解釋。本研究結(jié)果顯示Ann Arbor高分期者M(jìn)YC/BCL-2共表達(dá)顯著增高，也提示具有這一免疫表型的DLBCL有更強(qiáng)侵襲播散能力。較傳統(tǒng)遺傳學(xué)“雙打擊”淋巴瘤而言，MYC/BCL-2免疫組化共表達(dá)淋巴瘤擴(kuò)大了侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤的范圍，有必要探索新的治療方案和采用更有效的預(yù)后指標(biāo)對這類病變進(jìn)行治療和監(jiān)控。

Hans分型也是B細(xì)胞淋巴瘤常用以評估預(yù)后的危險因素之一，通過免疫組化CD10、Bcl-6和MUM-1三者的結(jié)果組合將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞型(GCB型)和非GCB型(non-GCB型)。盡管多數(shù)研究認(rèn)為GCB型較non-GCB型預(yù)后相對較好，但在臨床實(shí)踐中，兩種類型的異質(zhì)性較明顯，也有部分non-GCB型預(yù)后好而GCB型預(yù)后很差[15]。MYC/BCL-2共表達(dá)與Hans分型的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，MYC/BCL-2共表達(dá)在non-GCB型的DLBCL中比例更高[2]。但這一結(jié)果并不確定，本研究結(jié)果和國內(nèi)楊帆等研究均未能得出這一結(jié)論[16]，其原因可能與病例樣本數(shù)量較小有關(guān)。盡管單因素BCL-2蛋白表達(dá)是GCB及non-GCB患者的不良預(yù)后因素[17]，但更多的研究并不建議把DLBCL分成ABC和GCB或是免疫組化分型的GCB型和non-GCB型，因?yàn)槁?lián)合MYC/BCL-2蛋白表達(dá)情況評估預(yù)后比細(xì)胞起源分類更有效[2，4]。

綜上所述，本研究結(jié)果提示MYC/BCL-2共表達(dá)可能是DLBCL的特殊免疫組化表型，拓展了傳統(tǒng)遺傳學(xué)“雙打擊”淋巴瘤的范圍，為利妥昔單抗初治DLBCL患者預(yù)后判斷提供了更多依據(jù)，作為標(biāo)準(zhǔn)IPI預(yù)后評分的補(bǔ)充，對探索DLBCL新治療方案提供明確的蛋白表型和分子靶點(diǎn)。

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TheclinicopathologicalsignificancesofMYCandBCL-2co-expressionindiffuselargeBcelllymphoma

HU Mingjuan，LI Guowei,OUYANG Xiaoming

(DepartmentofPathology，HuaduDistrictPeople’sHospitalofGuangzhouCity，Guangzhou510800，Guangdong，China)

ObjectiveTo assay the expression of MYC and BCL-2 proteins in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL),and to investigate the clinicopathological significances of MYC/BCL-2 co-expression in DLBCL.MethodsArchived 76 DLBCL,NOS were collected and analyzed retrospectively.The clinicopathological characteristics,including Ann Arbor staging,the international prognostic index (IPI) score,Hans’s classification and therapeutic effects,were re-evaluated.The co-expression of MYC/BCL-2 was detected by immunohistochemical staining using EnVision detection system.ResultsMYC or BCL-2 expression could be detected in 55 cases (72.4%) and 41 cases (53.9%),respectively.The co-expression of MYC/BCL-2 was observed in 33 cases (43.4%).There was a close relationship found between co-expression of MYC/BCL-2 and higher Ann Arbor staging (P=0.011),or worse therapeutic effect of patient (P=0.002).However,co-expression of MYC/BCL-2 was not correlated to other clinicopathological features,such as tumor site and Hans’s classification.In addition,there was no correlation found among IPI score and all of clinicopathological features of DLBCL in this study.ConclusionsCo-expression of MYC/BCL-2 in tumor cells might be a specific immunohistochemical phenotype of DLBCL,and combined with standard IPI score,which might be a valuable prognostic factor for DLBCL patients with rituximab treatment.

Diffuse large B-cell lymphoma; MYC; BCL-2; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.017

2016-12-09；

2017-04-28

*通訊作者，E-mail：694777171@qq.com.

R733

A

蔣湘蓮)