三鄰甲苯基磷酸酯的神經毒性研究進展

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(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南 衡陽421001；2. 南華大學公共衛(wèi)生學院)

·小專論·

三鄰甲苯基磷酸酯的神經毒性研究進展

江嵐1,2，龍鼎新2

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南 衡陽421001；2. 南華大學公共衛(wèi)生學院)

三鄰甲苯基磷酸酯(TOCP)是眾多有機磷酸酯類化合物代表之一，有多器官毒性作用主要表現在對動物生殖毒性、免疫毒性和神經毒性。本文主要綜述了TOCP分子理化特性、TOCP神經毒性作用的研究，并從骨架蛋白含量改變、氧化應激、細胞凋亡與細胞自噬等方面對TOCP神經毒性作用機制進行了綜述。

三鄰甲苯磷酸酯(TOCP)； 神經毒性； 有機磷酯類化合物誘發(fā)的遲發(fā)性神經毒性(OPIDN)

1 TOCP分子理化特性與用途

三鄰甲苯基磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)屬于三甲苯磷酸酯的鄰、對及間位3種異構體中的一種，三鄰甲苯磷酸酯的分子式為C21H21O4P，分子量為368.36。分子結構數據如下：摩爾折射率為102.14，摩爾體積為306.6 m3/mol，等張比容(90.2 K)為793.2，表面張力為44.7 dyne/cm，極化率(10～24 cm3)為40.49。其分子結構如下(圖1)。

圖1 三鄰甲苯磷酸酯結構式

常溫下，TOCP是無味、微黃透明的液體。不溶于水，能溶于醇、醚、苯等有機溶劑。由于具有化學與熱穩(wěn)定性，可用作增塑劑，阻燃劑、軟化劑使用，常用于塑料、橡膠、涂料及合成纖維等工業(yè)，也可作為機油添加劑與汽油中鉛的凈化劑等[1-2]。因此，TOCP在工業(yè)上及日常生活中TOCP用途極為廣泛。

2 TOCP的神經毒性作用

關于TOCP的神經毒性，目前有三種不同的毒性結局：(1)抑制膽堿酯酶而誘發(fā)急性中毒；(2)短期或長期多次接觸TOCP可以引起神經退行性綜合癥；(3)一次或多次接觸TOCP引起的遲發(fā)性神經毒性(organophosphoms ester-induced delayed neurotoxieity，簡稱OPIDN)[2]。遲發(fā)性神經毒性是TOCP的神經毒性中最為常見的癥狀。早在20世紀30年代，美國有上萬人因飲用污染了TOCP的牙買加姜汁酒發(fā)生癱瘓；隨后南非和摩洛哥、斯里蘭卡和印度等其他國家也出現因食用TOCP污染食用油而導致人群癱瘓的中毒事件[3]。我國自20世紀90年代初以來，在北京、西安和深圳等地也相繼發(fā)生多起因食用污染TOCP面粉和食用油而導致同類事件[4]。由于TOCP能誘發(fā)遲發(fā)性神經毒素，造成以肢體遠端運動障礙功能為主的周圍神經脫髓鞘病變。該病可持續(xù)數十年，嚴重者能導致終生殘疾，危害十分嚴重，人們對其的重視度逐漸提高。

3 TOCP神經毒性作用機制

3.1骨架蛋白含量改變TOCP處理后雞大腦組織中神經絲含量變化比微管與微絲蛋白大，該變化可能與OPIDN有關。 研究表明，TOCP處理之后，雞的脊髓神經細胞膜上的[3H]DFP(diisopropy-lfluorophosphate)結合量降低[5],而各段脊髓神經細胞膜之間[3H]DFP的結合量變化不大。推測TOCP先結合脊髓神經細胞膜上的特異性蛋白，由于特異性蛋白和[3H]DFP之間存在競爭，使[3H]DFP的結合受到抑制。隨著TOCP處理后時間的增加，結合受體代謝了TOCP，從而結合受體的量變小，使[3H]DFP結合到空余的受體上，使[3H]DFP的結合量升高。TOCP和DFP都具有遲發(fā)性神經毒性，因此，脊髓神經細胞膜上的特異性位置可能與OPIDN相關。還發(fā)現，TOCP能致受試成年雞細胞周期蛋白依賴性激酶5(cyclin-dependent kinase5,CDK5)異常磷酸化增強[6]。已知CDK5異常激活及其磷酸化與神經退行性疾病的發(fā)生密切相關，CDK5與其它一些激酶一起共同對多種細胞骨架蛋白磷酸化，在神經軸突生長過程中調節(jié)骨架蛋白之間的相互作用[7-8],TOCP處理的實驗雞的中樞及外周神經軸突中確實有磷酸化骨架蛋白的異常聚集。細胞骨架蛋白磷酸化增強導致細胞骨架成分的降解，既而引起順行性軸漿運輸加速，最終導致降解后的細胞骨架成分在軸突末梢部位的聚集[9]。TOCP處理成年雞產生OPIDN，脊髓組織中NFs含量紊亂，預先用PMSF處理可阻斷OPIDN，并可顯著抑制脊髓NFs含量的紊亂[10]。

研究發(fā)現TOCP中毒可改變雞神經組織中的微管相關蛋白2(microtubulin-associated protein 2,MAP-2)含量，可能與其遲發(fā)性神經毒性相關。MAP-2是成熟神經元樹突的主要標志之一，已知微管是神經元細胞骨架的主要成分,在神經元正常結構和功能的維持中發(fā)揮重要作用[11]。TOCP處理是否直接損傷培養(yǎng)雞少突膠質細胞，TOCP對少突膠質細胞有直接作用，能使其突起變性損傷，胞體出現空泡樣變；推測少突膠質細胞損傷可能和OPIDN發(fā)病機制有關[12]。

3.2氧化應激研究表明，有機磷化合物能誘導機體氧化應激，生成活性氧，發(fā)生抗氧化反應[13-14]。TOCP作為一種有機磷酸酯類化合物，也能造成成年雞神經組織出現脂質過氧化導致氧化應激?？寡趸到y(tǒng)失衡、脂質過氧化可能為TOCP引起OPIDN的一個重要機制。TOCP引起母雞OPIDN中抗氧化系統(tǒng)和凋亡相關蛋白改變，隨時間推移TOCP使母雞神經組織與血清的脂質過氧化物增加，損傷其抗氧化防御系統(tǒng)；TOCP對坐骨神經影響較早、較敏感，坐骨神經脂質過氧化增強和抗氧化能力降低與其傳導功能降低顯著相關。隨著時間的推移，成年雞中樞神經組織中大腦與脊髓中Cyt-c蛋白的表達增加。體外實驗證明，TOCP對人成神經瘤細胞SH-SY5Y存在著氧化損傷，氧化應激產生的活性氧可以引起蛋白質的氧化損傷和錯誤折疊，導致細胞內蛋白結構的變化。為了防止過多氧化修飾蛋白以及其它受損蛋白在細胞內集聚而產生細胞毒性，細胞會啟動其保護機制—增加或加速異常蛋白的水解。研究表明，蛋白酶解系統(tǒng)在細胞對毒物或環(huán)境應激的應答等方面具有重要作用[15]。研究表明高濃度TOCP能顯著增加泛素化蛋白的集聚，并呈現較明顯的劑量效應關系。提示較高濃度的TOCP可致泛素蛋白酶體途徑的阻斷或抑制。

3.3細胞凋亡與細胞自噬有研究表明，TOCP誘發(fā)成年母雞遲發(fā)性神經毒性過程中出現腰髓前角神經元細胞凋亡的現象，而且神經元凋亡發(fā)生在遲發(fā)性神經毒性癥狀出現之前，提示細胞凋亡可能在遲發(fā)性神經病發(fā)病機制中起重要作用[16]。Mou DL等[17]發(fā)現TOCP誘發(fā)的OPIDN中母雞的脊髓神經元的損傷，電鏡觀察染毒第5天出現神經元的凋亡，均提示凋亡可能涉及OPIDN的發(fā)展。一些體外實驗發(fā)現,TOCP可明顯影響SH-SY5Y細胞的存活，并且具有濃度及時間效應關系，顯示TOCP能導致細胞死亡，但經流式細胞儀檢測，TOCP處理的SH-SY5Y細胞在其細胞周期直方圖上并未出現典型的亞二倍體凋亡峰，另外，凋亡促進基因P53在mRNA水平和蛋白水平均未見表達增強[18]。以上結果提示TOCP誘導的細胞死亡并非凋亡，有可能是程序性細胞死亡的另一種形式—自噬性細胞死亡。

自噬(autophagy)是近年來新發(fā)現的程序性細胞死亡方式，稱為Ⅱ型程序性細胞死亡。自噬與人類多種神經退行性疾病有關，如在帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等神經退行性疾病中可發(fā)現自噬體的積聚[19]。維持生理水平的自噬對神經細胞的健康和功能的發(fā)揮至關重要；而自噬的紊亂(自噬缺失或過度)則可導致神經突起的退行性病變及神經細胞死亡。本文作者發(fā)現 TOCP可導致SH-SY5Y細胞自噬性死亡，并且TOCP處理濃度與自噬發(fā)生呈正相關，TOCP導致骨架蛋白的降解方式包括自噬。在TOCP誘發(fā)成年雞的OPIDN中，脊髓、坐骨神經的自噬相關蛋白LC3的表達呈時間效應關系，隨著染毒時間的延長，OPIDN癥狀越明顯，蛋白表達增多，說明自噬與OP導致的OPIDN存在密切的聯(lián)系。TOCP染毒造成成年雞脊髓和脛神經里面的beclin-1含量明顯降低，但是u-calpain含量增加顯著。經過PMSF預處理在將TOCP造成的OPIDN的同時，可以顯著抑制TOCP引起的beclin降低和u-calpain含量的升高，推斷TOCP是神經元中的自噬調節(jié)機制[20]。

4 展 望

隨著科學技術的高速發(fā)展，TOCP方面的研究也逐漸從形態(tài)表現、生理生化性狀向分子生物學發(fā)展，其神經毒性機制也日益深化。而關于其解毒機制方面的研究卻少見報道，相信這方面會成為將來的研究熱點。TOCP神經毒性研究屬于一項綜合性的系統(tǒng)課題，涉及醫(yī)藥學、病理學、毒理學、動物學、分子生物學等諸多學科，需要多學科的專家進行整合研究，因此，多學科的交叉融合或許是將來的一個研究方向。

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2016-09-17；

2017-07-28

國家自然科學基金項目(81172712)；湖南省自然科學基金項目(11JJ6078)； 湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項目(09B087)；南華大學博士啟動基金項目(2010XQD19).

*通訊作者，E-mail:dxlong99@163.com.

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