rhEPO通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷

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(湖北省十堰市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北 十堰 442000)

·心腦血管病專題·

rhEPO通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷

向勇，朱建萍，劉丹榮*

(湖北省十堰市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北 十堰 442000)

目的研究重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)是否可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路來改善大鼠腦出血后的神經(jīng)元損傷。方法SD大鼠構(gòu)建腦出血(ICH)模型，并給予rhEPO藥物治療，采用TUNEL法和試劑盒檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白Caspase 9表達(dá)；采用Real-Time PCR法和Western blot法檢測PI3K、AKT的基因和蛋白磷酸化水平的表達(dá)。結(jié)果與ICH非治療組相比，rhEPO治療組中神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)和Caspase 9活性表達(dá)明顯降低(P<0.05)； rhEPO治療組PI3K和AKT的蛋白磷酸化水平表達(dá)和mRNA表達(dá)顯著升高 (P<0.05)。結(jié)論重組人促紅細(xì)胞生成素rhEPO具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號來改善大鼠腦出血后的神經(jīng)元損傷。

腦出血; 重組人促紅細(xì)胞生成素; 神經(jīng)保護(hù); PI3K/AKT; 大鼠

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH) 是臨床上一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，因其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點(diǎn)而嚴(yán)重危害人類的健康[1-2]。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，在腦組織中廣泛表達(dá)，對神經(jīng)細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用[3-4]。PI3K/Akt作為經(jīng)典的細(xì)胞信號通路，在細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡與代謝等方面起到了重要的作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠激活PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，起到抑制細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元損傷的作用[6]。但重組人促紅細(xì)胞生成素如何通過PI3K/Akt信號通路改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷的研究未見報道。本研究通過Rosenberg法建立大鼠腦出血ICH模型，觀察重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，及神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)情況，探討重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)購自上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司。一抗兔抗多克隆抗體p-PI3K、p-AKT、ACTB(美國SantaCruz生物技術(shù)有限公司)；二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測試驗盒、Caspase9活性檢測試劑盒(上海碧云天生物工程有限公司)。ABI-7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，SDS-PAGE電泳設(shè)備及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-rad公司)。

1.2實驗動物與分組處理45只成年雄性SD大鼠購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大鼠飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室，12h/12h晝夜循環(huán)光照，溫度為(23±1) ℃。大鼠構(gòu)建腦出血ICH模型，并隨機(jī)分為3組，每組15只。組別為：假手術(shù)對照組、腦出血ICH組和rhEPO治療組。于手術(shù)后48小時處死，并收集大鼠腦組織。

1.3方法

1.3.1 Rosenberg法腦出血模型的制備 Rosenberg法進(jìn)行大鼠腦出血模型的制備：大鼠稱重后給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300mg/kg)，于立體儀上固定。將大鼠骨膜剝離，用微量注射儀取大鼠自體不凝血60 uL，緩慢注入左側(cè)大鼠尾狀核部位，留針10 min后撤針，縫合切口制備ICH模型。假手術(shù)組不注血，其余步驟同上。治療組術(shù)后5min給予腹腔注射rhEPO(3000UI/Kg)；腦出血ICH組與假手術(shù)組術(shù)后5min給予腹腔注射生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)病學(xué)評分 手術(shù)后功能缺損按 Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分(見表1):累積 1 分以上即為成功模型。動物蘇醒后,觀察缺血動物的神經(jīng)功能缺失癥狀。

表1 Longa5分制評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測 用10%水合氯醛(300 mg/kg)將大鼠腹腔注射麻醉，用200 mL生理鹽水，200 mL 4%多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流固定。腦組織常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，連續(xù)石蠟切片3張(厚度5 μm)。

切片加入標(biāo)記液37 ℃孵育2 h后，加入生物素37 ℃孵育30 min。37 ℃恒溫孵育SABC試劑30 min，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色。切片用20×、40×物鏡顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細(xì)胞。每張切片選擇6個高倍鏡視野進(jìn)行計數(shù) (400×)，平均值即為切片凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3.4 凋亡蛋白活性檢測試劑盒檢測Caspase9 取大腦組織冰上裂解， 4 ℃離心后收集蛋白上清液。96孔板中加入用緩沖液稀釋的蛋白樣本50 uL反應(yīng)緩沖液(reaction buffer含10mM DTT)及5 uL 4mM LEHD-pNA底物，37 ℃孵育1h，在酶標(biāo)儀405nm測定其吸光值。Caspase-9活性單位(U)=(各組A值-凋零組A值)/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，每次重復(fù)3孔。

1.3.5 WesternBlot檢測PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平 取大腦組織冰上裂解2h，離心后用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg/μL。將各組蛋白樣品加入到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后按1∶ 1000的稀釋比例加入多克隆抗體PI3K、AKT和二抗。用ECL顯色劑顯色， 用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantity-one軟件對各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.3.6 Real-TimePCR檢測大鼠PI3K、AKT mRNA表達(dá)含量 采用Real-time熒光定量PCR法，用Trizol提取中腦黑質(zhì)RNA，用含有GDNA Eraser 的Prime Script?RT試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒(TaKaRa公司產(chǎn)品)，根據(jù)說明書進(jìn)行Real-time PCR操作。實驗采用相對定量,由PCR反應(yīng)獲取閾值循環(huán)數(shù)(cycle threshold,CT)，采取CT值比較法，計算不同樣本之問的相對百分比。公式:ΔΔCT=(CT.實驗組的基因-CT.實驗組管家基因)-(CT.對照組目的基因- CT.對照組管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)組織學(xué)評分手術(shù)后功按 Longa5分制標(biāo)準(zhǔn)判定： 腦出血ICH組1級判定為8只，2級判定為3只，3級判定為2只；rhEPO治療組，1級判定為7只，2級判定為2只，3級判定為1只。結(jié)果說明rhEPO可以顯著改善大鼠腦出血后神經(jīng)元的損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用(見表2)。

2.2凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)對照組僅見少量凋亡細(xì)胞(43.86±10.07)個，而腦出血ICH組凋亡細(xì)胞數(shù)量(191.03±14.75)個和rhEPO治療組(130.15±14.94)個凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多；與腦出血ICH組相比，rhEPO治療組凋亡細(xì)胞明顯減少。

表2 腦出血模型成功評價表

圖1 TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測(400×)A：假手術(shù)對照組；B：腦出血ICH組；C：rhEPO治療組。與假手術(shù)對照組相比，**：P<0.01；與腦出血ICH組相比， #：P<0.05。

圖2 Caspase 9活性與假手術(shù)對照組相比，*：P<0.05,**：P<0.01；與腦出血ICH組相比， #：P<0.05。

2.3大腦組織Caspase 9活性如圖2，假手術(shù)對照組Caspase 9活性(0.83±0.07)U、腦出血ICH組Caspase 9活性(2.21±0.23)U和rhEPO治療組的Caspase 9活性(1.66±0.11)U具有顯著性差異。假手術(shù)對照組中Caspase 9活性相比，腦出血ICH組和rhEPO治療組中的Caspase 9活性均顯著增加；與腦出血ICH組的Caspase 9活性相比，rhEPO治療組的Caspase 9活性顯著降低。

2.4大腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平如圖3，與假手術(shù)對照組p-PI3K蛋白含量(0.94±0.12)和p-AKT的蛋白含量(0.98±0.16)相比，腦出血ICH組中p-PI3K蛋白含量(0.52±0.09)和p-AKT的蛋白含量(0.62±0.05)顯著降低；rhEPO治療組中p-PI3K蛋白含量(1.66±0.15)和p-AKT的蛋白含量(1.79±0.11)顯著升高，與腦出血ICH組相比，rhEPO治療組中p-PI3K、p-AKT的蛋白含量顯著升高，說明rhEPO治療組中PI3K/AKT信號通路被激活，rhEPO可以調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的蛋白水平來治療大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷。

2.5 PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平如圖4，與假手術(shù)對照組PI3K mRNA表達(dá)含量(1.00±0.00)和AKT的mRNA表達(dá)(1.00±0.00)相比，腦出血ICH組中PI3K mRNA表達(dá)含量(0.64±0.11)和AKT的mRNA表達(dá)含量(0.46±0.08)顯著降低；rhEPO治療組中PI3K mRNA表達(dá)含量(2.51±0.13)和AKT的mRNA表達(dá)顯著(1.25±0.07)升高。與腦出血ICH組相比，rhEPO治療組中PI3K、AKT的mRNA表達(dá)含量顯著升高，說明rhEPO治療組中PI3K/AKT信號通路被激活，rhEPO可以調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路的基因水平來治療大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷。

圖3 PI3K、AKT蛋白表達(dá)含量A：western blot測定蛋白表達(dá)含量；B 和 C：蛋白表達(dá)相對含量。與假手術(shù)對照組相比，*：P<0.05； **： P<0.01；與腦出血ICH組蛋白含量相比， #：P<0.05；##：P<0.01。

圖4 PI3K、AKT mRNA表達(dá)含量 A：PI3K；B：AKT與假手術(shù)對照組相比，*：P<0.05； **：P<0.01；與腦出血ICH組mRNA表達(dá)相比， #：P<0.05；##：P<0.01

3 討 論

腦出血后血腫周圍腦組織內(nèi)發(fā)生一系列的繼發(fā)性損傷，促使部分正常神經(jīng)元轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲錾窠?jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死加重神經(jīng)功能障礙[7-9]。那么減輕腦水腫和減少出血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡是減輕腦損傷、恢復(fù)腦組織功能和治療腦出血的關(guān)鍵[10-11]。PI3K作為一種磷脂酰肌醇激酶，參與細(xì)胞生長及骨架重塑的重要激酶，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[5]。其激活后可導(dǎo)致脂質(zhì)底物磷酸化并激活下游蛋白激酶B，即AKT，在細(xì)胞的增殖與分化中起到重要作用[12]。有報道，Akt 可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 Caspase9、NF-κB、mTOR等，而介導(dǎo)胰島素、多種生長因子等誘發(fā)的細(xì)胞生長，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與代謝過程[13-14]。研究表明， rhEPO可以有效的緩解細(xì)胞損傷作用，改善患者腦功能和認(rèn)知功能，提高患者生活質(zhì)量和集體活動能力。但重組人促紅細(xì)胞生成素是否可以調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路改善大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷的研究未見報道。

本實驗通過Rosenberg法建立大鼠ICH模型，旨觀察rhEPO對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控及抗細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，ICH組大鼠大腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)和Caspase 9活性均顯著增加，說明大鼠腦出血ICH模型構(gòu)建成功，神經(jīng)元受損。但rhEPO治療組與腦出血ICH組相比，rhEPO治療組中的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，Caspase 9活性明顯降低，說明rhEPO治療后可減輕細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)元損傷。WesternBlot和Real-Time PCR結(jié)果表明，腦出血ICH組和rhEPO治療組大腦組織中PI3K、AKT的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)與假手術(shù)對照組相比均具有顯著差異，說明PI3K和AKT參與了腦出血神經(jīng)損傷的過程，參與了細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控；而rhEPO治療組中PI3K、AKT的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)含量均比腦出血ICH組顯著增高，說明rhEPO治療后PI3K/AKT信號通路被明顯激活，產(chǎn)生顯著的抗細(xì)胞凋亡作用，降低大腦神經(jīng)元的損傷。本實驗研究表明，PI3K、AKT的表達(dá)在腦出血發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，rhEPO可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路來治療大鼠腦出血后神經(jīng)元損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。但抗細(xì)胞凋亡作用的結(jié)論神經(jīng)元損傷的信號通路有許多，如MAPK、PKC等，rhEPO是否可以通過其他信號通路來改善大鼠神經(jīng)功能損傷還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，rhEPO的神經(jīng)保護(hù)可以通過調(diào)節(jié) PI3K/AKT信號通路，產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用來實現(xiàn)。了解腦出血的發(fā)生發(fā)展過程及rhEPO的神經(jīng)保護(hù)作用，對于治療腦出血、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡減少神經(jīng)元損傷具有重要的臨床意義。

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Beneficialeffectofrecombinanthumanerythropoietin(rhEPO)onneuronalinjuryinintracerebralhemorrhageratsviaPI3K/AKTsignalingpathway

XIANG Yong,ZHU Jianping,LIU Danrong*

(DepartmentofNeurology,ShiyanPeople’sHospitalofHubei，Shiyan442000,Hubei,China)

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant human erythropoietin (rhEPO) on neuronal injury after intracerebral hemorrhage in rats and PI3K/ AKT signaling pathway.MethodsSD rats were used to construct intracerebral hemorrhage (ICH) model,and rhEPO was given to therapy rats.The apoptosis of neurons was detected by TUNEL method.The expression of Caspase 9 was detected by assay kit.Real-time PCR and Western blot were used to detect the expression of PI3K and AKT mRNA expression.ResultsCompared with ICH group,the number of apoptotic cells and the expression of Caspase 9 in rhEPO group were significantly decreased,the expression of PI3K and AKT protein phosphorylation and mRNA expression in rhEPO group were significantly higher than those in control group (P <0.05).ConclusionRecombinant human erythropoietin rhEPO obviously has a neuroprotective effect in rats,which could be used to reduce neuronal injury after intracerebral hemorrhage by regulating PI3K/ AKT signaling.

intracerebral hemorrhage; rhEPO; neuroprotection; PI3K/AKT; rat

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.05.007

欄目主持人——曾高峰教授

2016-12-15；

2017-08-25

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秦旭平)