食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸同時(shí)測定的HPLC方法

□ 于喆源 張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 張 婕 蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所

食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸同時(shí)測定的HPLC方法

□ 于喆源 張掖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 張 婕 蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸是目前國家允許使用的食品添加劑，很多食品經(jīng)常會幾種同時(shí)添加。本文試圖通過對上述幾種物質(zhì)的化學(xué)特征和性質(zhì)進(jìn)行分析，建立同時(shí)分析上述4種目標(biāo)物的高效液相色譜分析方法。研究結(jié)果表明：采用水相超聲提取作為前處理手段，采用封尾工藝的C18色譜柱，乙酸鈉緩沖鹽溶液（pH=4.5）-甲醇體系為流動相，梯度洗脫方式，通過二極管陣列檢測器在230 nm、293 nm處同時(shí)檢測，可以較好地對4種目標(biāo)物進(jìn)行分析，并且克服了單純等度洗脫糖精鈉保留時(shí)間對有機(jī)相比例過于敏感的問題和國家標(biāo)準(zhǔn)中脫氫乙酸保留時(shí)間漂移，峰形拖尾嚴(yán)重的問題。經(jīng)驗(yàn)證，此方法回收率、精密度、檢出限、重復(fù)性均良好。

苯甲酸；山梨酸；糖精鈉；脫氫乙酸；高效液相色譜

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸是目前國家允許使用的食品添加劑[1]，它們的分子結(jié)構(gòu)如圖1—4所示。但此類物質(zhì)攝入過多會造成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)[2]，所以同時(shí)準(zhǔn)確高效地檢測變得愈發(fā)重要?，F(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)中，同時(shí)測定多種添加劑的方法較少，這給實(shí)際檢驗(yàn)工作（需要滿足高效準(zhǔn)確的要求）帶來了一定難度。所以，需要開發(fā)改進(jìn)同時(shí)檢驗(yàn)上述4種添加劑的方法[3-6]。

圖1 苯甲酸分子結(jié)構(gòu)（CAS：65-85-0）

圖2 山梨酸分子結(jié)構(gòu)（CAS：110-44-1）

圖3 糖精鈉分子結(jié)構(gòu)（CAS：128-44-9）

目前，同時(shí)測定上述4種添加劑的國家標(biāo)準(zhǔn)尚未發(fā)布，部分地標(biāo)采用磷酸鹽緩沖液-甲醇體系的方法，雖然通過增加離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)了分析目的，但對色譜柱壽命存在一定影響且對色譜柱要求較高[7]。為此本文通過對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的化學(xué)特征和性質(zhì)的分析，通過選擇合適的色譜條件及樣品前處理方法，提出改進(jìn)方法，盡可能地達(dá)到穩(wěn)定準(zhǔn)確分析的目的。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：安捷倫1260型，配有二極管陣列檢測器。萬分之一天平： EL204-IC，瑞士梅特勒。千分之一天平：ML503/02，瑞士梅特勒。離心機(jī)：10 000 r/min，TGL-16a高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司。酸度計(jì)：梅特勒320型，瑞士梅特勒。甲醇：色譜純，德國默克進(jìn)口。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國sigma公司。其他試劑均為優(yōu)級純。實(shí)驗(yàn)用水為滿足GB/T 6682-2008的一級水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

苯甲酸儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。4 ℃保存，3個月有效。

山梨酸儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。4 ℃保存，3個月有效。

糖精鈉儲備液（1.0 mg/mL）：精密稱取糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。4 ℃保存，3個月有效。

脫氫乙酸儲備液（1.0 mg/mL）∶精密稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg至100 mL容量瓶，用20 mL氫氧化鈉溶液（20 g/L）溶解后用水定容。4 ℃保存，3個月有效。

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的苯甲酸儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、?10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的山梨酸儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的糖精鈉儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分別吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20 mL的脫氫乙酸儲備液，用水定容至100 mL容量瓶中。制成濃度為1.00、5.00、10.0、50.0、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。4 ℃保存，一個月有效。

1.3 樣品處理

圖6 20%甲醇流動相色譜圖

稱取樣品2 g（液體樣品吸取2 g）至50 mL離心管中，精密加水25 mL，超聲處理30 min，然后分別精密加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各2.5 mL，振搖，8 000 r/min離心10 min，取上清液，分別用乙酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7[8]，過0.45 μm濾膜后上機(jī)。

1.4 色譜條件

C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，采用封尾工藝），乙酸鈉（pH=4.5）緩沖液-甲醇體系流動相，檢測器波長：293 nm，230 nm。進(jìn)樣量：10 μL，流速1 mL/min，柱溫：40 ℃，保留時(shí)間定性，峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相與檢測波長的選擇

國家標(biāo)準(zhǔn)采用乙酸銨緩沖液-甲醇體系，在實(shí)驗(yàn)過程中，容易造成山梨酸與脫氫乙酸不能完全被分離，且苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸峰形有明顯拖尾。分析原因，因?yàn)榱鲃酉囿w系接近中性環(huán)境，不利于減少上述酸性物質(zhì)的自生解離帶來的與色譜柱未鍵合硅羥基強(qiáng)的次級保留，造成拖尾和保留時(shí)間不穩(wěn)定。為了克服以上問題，得到穩(wěn)定的色譜結(jié)果，本文選擇采用pH=4.5的醋酸鈉緩沖液-甲醇體系進(jìn)行分析。檢測波長，對于苯甲酸、山梨酸、糖精鈉依國家標(biāo)準(zhǔn)采用230 nm，脫氫乙酸在上述波長下雖然也有明顯吸收，但在實(shí)測樣品時(shí)，容易受基質(zhì)峰干擾，故繼續(xù)按國家標(biāo)準(zhǔn)293 nm作為檢測波長。

表1 流動相梯度表

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

表3 加標(biāo)回收率

2.2 洗脫方式選擇

4種被測物中，糖精鈉保留時(shí)間對有機(jī)相比例敏感，當(dāng)有機(jī)相比例大于10%時(shí)，洗脫順序依次為糖精鈉、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸。

圖7 梯度洗色譜圖

在使用等度洗脫方式時(shí)，采用15%有機(jī)相比例，雖然可以獲得較好的分離效果，但是總洗脫時(shí)間為30 min左右，如圖5所示，對實(shí)際工作中的大批量檢品不適用；采用20%的有機(jī)相，總洗脫時(shí)間在21 min左右，但糖精鈉洗脫過快，山梨酸和脫氫乙酸的分離度不夠，如圖6所示，在實(shí)際樣品檢測中容易被干擾。

所以，經(jīng)過嘗試，本文采用梯度洗脫方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，梯度變化見表1。

采用如上洗脫方式，如圖7所示，糖精鈉洗脫時(shí)間為6.5 min，可以有效避免干擾；同時(shí)，山梨酸和脫氫乙酸分離度滿足實(shí)際需要，峰形對稱性達(dá)到0.989，無拖尾現(xiàn)象；總洗脫時(shí)間為24分鐘，達(dá)到預(yù)期。

2.3 方法檢出限和線性

按1.2所述，配置標(biāo)準(zhǔn)曲線，以上述色譜條件為實(shí)驗(yàn)條件，以濃度為橫坐標(biāo)（x軸），峰面積為縱坐標(biāo)（y軸）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，并以3倍信噪比計(jì)算檢出限，見表2，結(jié)果良好，符合要求。

2.4 精密度與加標(biāo)回收率

取同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液（均取10 μg/mL），重復(fù)進(jìn)樣7次，測定其峰面積并計(jì)算RSD值，小于2.0%，精密度良好。然后取1.2所述儲備液100 μL，加入樣品，按1.3進(jìn)行處理，得到下述結(jié)果，見表3，回收率良好。

3 結(jié)論

通過對苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸的化學(xué)性質(zhì)分析和實(shí)驗(yàn)，得出在采用乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）-甲醇體系為流動相，梯度洗脫方式，樣品水相超聲提取的情況下，可以得到穩(wěn)定良好的結(jié)果，有效地提高了檢驗(yàn)效率，適應(yīng)目前食品檢測高效準(zhǔn)確的要求。

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