洋桔梗Ceremony Orcmge品種輻射誘變育種

陳淑英， 王玉英， 李葉芳， 何文俊， 宗積意， 宋 蓮， 張宇歡， 李枝林，2

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所，云南昆明 650201； 2.生物多樣性與云南特色農(nóng)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，云南昆明 650201)

洋桔梗(Enstomagrandiflorum)別稱草原龍膽、大花桔梗、麗缽花，是龍膽科龍膽屬1年生觀賞植物[1]，原生長于美國南部至墨西哥之間的石灰?guī)r地帶，是遍布北美草原的野花，后引種到歐洲和日本，經(jīng)園藝工作者們多年的培育、雜交改良，近10年間洋桔梗的育種與生產(chǎn)有了迅速的發(fā)展，尤以日本為盛，現(xiàn)已成為花形、花色多樣，株型妖媚多姿的鮮切花品種[2]。洋桔梗種子細(xì)小，價(jià)格昂貴，且種子萌發(fā)緩慢、幼苗生長緩慢，從播種到定植(3對(duì)葉)有2～3個(gè)月時(shí)間，其間受環(huán)境的影響很大，育苗技術(shù)要求很高，種苗供應(yīng)受限制，我國洋桔梗育種工作仍處于停滯階段[3]。

輻射可以提高植物的突變率，在較短的時(shí)間內(nèi)獲得更多的優(yōu)良變異植株，為進(jìn)一步良種選育提供材料，縮短育種時(shí)間[4]。相關(guān)報(bào)道表明，至今世界上已經(jīng)有50多個(gè)國家在150多種植物上應(yīng)用核誘變育種，已成功育成了1 737個(gè)品種，其中農(nóng)作物比例最高，達(dá)74%，約1 275個(gè)品種[5]。我國已對(duì)40多種花卉進(jìn)行核輻射育種改良，且已成功獲得60多個(gè)突變種，主要集中在菊花[6]、蘭花[7]、百合[8]、月季[9]、觀賞性海棠[10]、水仙[11]和蝴蝶蘭[12]等。有關(guān)洋桔梗物理誘變育種的研究，目前國內(nèi)尚未見任何報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以洋桔梗組培苗為材料，進(jìn)行不同劑量的60Coγ射線照射，探索適宜的處理劑量，為洋桔梗輻射育種提供技術(shù)依據(jù)和試驗(yàn)方法基礎(chǔ)，以期創(chuàng)造出新、奇、特的洋桔梗變異類型，豐富洋桔梗種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所提供的洋桔梗品種Ceremony Orcmge組培苗，平均株高4 cm。

1.2 方法

2015年10月對(duì)處理材料在云南華源輻射有限公司進(jìn)行60Coγ射線處理，劑量為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 Gy，劑量率為1 Gy/min，急性照射后培育4個(gè)月，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，進(jìn)行形態(tài)觀察和記錄，直到損傷苗穩(wěn)定為止。其中，變異指葉片變厚、扭曲、呈圓筒狀、葉色變深或黃化等形態(tài)異?，F(xiàn)象；變異率指變異苗數(shù)與處理苗數(shù)的比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2003整理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0計(jì)算半致死劑量，LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量 60Co γ射線對(duì)洋桔梗組培苗死亡率的影響

在4個(gè)月內(nèi)連續(xù)對(duì)輻射處理后的洋桔梗進(jìn)行觀察，其生長和死亡統(tǒng)計(jì)情況見表1。

表1 不同劑量 60Co γ射線對(duì)洋桔梗組培苗死亡率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

由表1可知，不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗成活率[成活率=(1-死亡株數(shù)/總株數(shù))×100%]影響顯著。處理劑量為90、100 Gy時(shí)，成活率分別顯著低于對(duì)照組46、53百分點(diǎn)(P<0.05)。隨著輻射劑量的增加，影響程度變大，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。輻射劑量越小，死亡的植株越少，成活率越高；輻射劑量越大，死亡植株越多，成活率越低。高劑量不僅增加了洋桔梗的死亡率，而且加快了植株的死亡速度，死亡首先從植株的莖尖部開始，然后葉片死亡，最后整株死亡，幼嫩的植株最先死亡。上述結(jié)果表明，輻射對(duì)幼嫩的器官組織損傷最大，成熟組織損傷較小。

2.2 洋桔梗組培苗的半致死劑量

為了達(dá)到較多變異，又不致過于損傷植株，實(shí)際應(yīng)用中經(jīng)常用半致死劑量(semi-lethal dose)作為衡量指標(biāo)。計(jì)算半致死劑量，常用概率單位回歸法分析死亡率與輻射劑量之間的關(guān)系。通過盧紋岱SPSS軟件得到輻射效果模型為：Probit(P)=-2.00+0.019[lg(dose)]。得出洋桔梗的半致死劑量計(jì)算式lg(semi-lethaldose)=2.00/0.01，得到半致死劑量為103.63。皮爾遜擬合優(yōu)度的卡方檢驗(yàn)顯示，它們的顯著水平為0.978(大于0.15，SPSS默認(rèn))，由此判斷方程式滿足數(shù)據(jù)的擬合優(yōu)度。

表2表明，輻射效果模型所期望觀察到的每個(gè)劑量的死亡數(shù)與實(shí)際觀察到的死亡數(shù)完全在誤差允許范圍內(nèi)， 由此可以判斷輻射效果模型是可靠的。

表2 觀測與期望數(shù)頻

由輻射效果的模型在95%置信區(qū)間內(nèi)求得的各死亡率的輻射劑量見表3，由此可知各輻射劑量都在上限與下限之間。

表3 因子變量95%的置信區(qū)間

從圖1可知，不同劑量的散點(diǎn)圖呈線性關(guān)系，說明用Log Base10的選項(xiàng)進(jìn)行轉(zhuǎn)換是合適的。

2.3 60Co γ射線輻射處理對(duì)洋桔梗組培苗表型的影響

由圖2可知，經(jīng)過輻射后，對(duì)洋桔梗植株的形態(tài)等會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響，輻射劑量越大，對(duì)植株的影響程度越大，輻射劑量越小，對(duì)植株的影響程度越小。沒有經(jīng)過輻射的洋桔梗苗葉色是綠色的，植株形態(tài)正常，經(jīng)過輻射的植株出現(xiàn)了黃化，葉片變小、變厚、變黑、有斑，有的葉片像水浸狀，植株出現(xiàn)畸形等現(xiàn)象。隨著輻射劑量的增加，黃化、葉片變黑情況加重，葉色黃綠或黃白。從表型變化上看，60Coγ射線對(duì)洋桔梗組培苗的誘變效果明顯。

由表4可知，不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗株高的影響差異顯著。處理劑量為90、100 Gy時(shí)株高分別顯著低出對(duì)照組47%、50%(P<0.05)。隨著處理劑量的升高，洋桔梗組培苗株高逐漸降低，可見60Coγ射線對(duì)矮化植株有明顯效果。

2.4 不同劑量的 60Co γ射線對(duì)洋桔梗組培苗變異率的影響

由表5可知，不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗變異率的影響差異顯著。處理劑量為90、100 Gy時(shí)，變異率分別顯著高出對(duì)照組51%、45%(P<0.05)。隨著處理劑量的升高，洋桔梗組培苗的變異率先升高后降低。植株變異率的峰值出現(xiàn)在90～100 Gy，50 Gy后升高的趨勢比較明顯，100 Gy后隨劑量的升高變異率降低。由于死亡率隨劑量的升高而增加，故變異率并非隨著劑量升高而增加。但相對(duì)變異率(處理后存活苗中變異苗數(shù)與存活苗數(shù)的比值)隨著劑量的升高而升高。原因是輻射劑量越高，損傷越重，分化出來的芽體越容易發(fā)生變異。但過高劑量處理后存活的材料常因細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷造成劣性突變或致死突變而掩蓋其他突變，不利于輻射育種。

表4 不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗株高的影響

2.5 不同劑量的 60Co γ射線對(duì)洋桔梗組培苗增殖率的影響

由表6可知，不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗增殖率的影響差異顯著。處理劑量為90、100 Gy時(shí)，增殖率分別顯著低出對(duì)照組49%、59%(P<0.05)。隨著處理劑量的升高，洋桔梗組培苗的增殖率逐漸降低。這應(yīng)該是因?yàn)檩椛浜蟊砻娴募?xì)胞造成較嚴(yán)重的損傷，從而使其恢復(fù)生長的能力受到嚴(yán)重的破壞，分化能力也隨之下降。

表5 不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗變異率的影響

表6 不同劑量射線對(duì)洋桔梗組培苗增殖率的影響

3 討論與結(jié)論

不同材料對(duì)射線的敏感性不同，對(duì)射線的敏感性大小依次為愈傷組織>試管苗>田間苗>根芽>插條>種子。組培苗含水量較高，在射線處理下會(huì)產(chǎn)生很多氧自由基，破壞核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，是輻射誘變育種的理想材料。此外，輻射育種與組織培養(yǎng)結(jié)合可以提高變異保存率，克服扦插分離不徹底的缺點(diǎn)，加快變異的純合，從而縮短育種周期。王晶等研究60Coγ射線對(duì)菊花的誘變效應(yīng)選用的是組培苗[13]；潘宏用蘭花組培苗進(jìn)行蘭花輻射誘變育種[14]；張興等進(jìn)行豐花月季60Coγ輻射育種選用材料也是月季組培苗[15]。因此，本試驗(yàn)選用洋桔梗組培苗為處理材料。

輻射產(chǎn)生誘變有2個(gè)方面主要原因：一是輻射后引起遺傳物質(zhì)的突變，如染色體的畸變、DNA分子的變異；二是RNA、蛋白質(zhì)的生物合成受到抑制，生長素及酶等生理活性物質(zhì)的代謝受到破壞，表現(xiàn)出細(xì)胞死亡、細(xì)胞突變，從而對(duì)生物產(chǎn)生抑制作用。劉麗強(qiáng)等在探討60Coγ輻射對(duì)觀賞海棠組培苗的輻射誘變效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，生根和繼代組培苗的生根率、平均根長、苗高、增殖等隨著60Coγ射線劑量的增加而明顯下降[10]。高年春等用60Coγ輻射非洲菊組培苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)輻射處理后非洲菊的株高、生根率、黃化率與輻射劑量呈負(fù)相關(guān)[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在0～150 Gy射線范圍內(nèi)，洋桔梗組培苗死亡率隨照射射線劑量增加而增加，而增殖率與變異率呈負(fù)相關(guān)，這與前人的研究結(jié)果一致。

由于輻射誘變是隨機(jī)事件，因此對(duì)一定的靶標(biāo)照射劑量越大，引起誘變的概率越大，并且電離輻射對(duì)植物的損傷和抑制作用也越大。因此有一些學(xué)者建議，其誘變成功率由植物成活率與突變率的乘積決定，對(duì)應(yīng)最大概率積的劑量才是最適劑量。本次試驗(yàn)中輻照劑量為90 Gy時(shí)，洋桔梗的死亡率為46%，變異率為51%，達(dá)到最高，因此90 Gy作為洋桔梗的輻射劑量更適宜。彭綠春等用60Coγ射線對(duì)4種蘭花作輻照處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬鳳蘭、竹葉蘭、碧玉蘭、西藏虎頭蘭組培苗的半致死劑量分別為20.72、26.31、29.88、41.04 Gy[17]。楊靜坤等用60Coγ射線作誘變劑發(fā)現(xiàn)，碧玉蘭組培苗半致死劑量為28.88 Gy[18]。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，洋桔梗組培苗半致死劑量為103.63 Gy。彭綠春等選用的材料是蘭花原球莖[17-18]，而本試驗(yàn)的輻照材料是具有根、莖、葉的組培苗，這可能與植物種類、不同組織器官對(duì)輻射敏感不同有關(guān)。

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