腦缺血中一氧化氮前體／供體的作用研究

周佩洋，任自敬，孫成林，劉廣志，姚 旋，曹治華，王 璞，高 平

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 襄陽 441000）

腦缺血中一氧化氮前體／供體的作用研究

周佩洋，任自敬，孫成林，劉廣志，姚 旋，曹治華，王 璞，高 平

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 襄陽 441000）

目的觀察一氧化氮（nitric oxide，NO）前體／供體對大鼠腦損傷的保護作用，并檢測大腦中動脈栓塞對大鼠腦組織微管相關(guān)蛋白2（MAP－2）表達的影響。方法將66只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（sham組，n＝12）、大腦中動脈栓塞模型（MCAO）組（n＝18）、硝酸甘油（nitroglycerin，NG）治療組（n ＝18）、精氨酸（arginine，ARG）治療組（n ＝ 18）。sham 組僅進行手術(shù)，不造成缺血事實；其余組采用 Zea－Longa改良法線栓法制作成MCAO模型，缺血2 h后再灌注即刻介入給藥。各組大鼠術(shù)后立即肌肉注射注射用青霉素鈉6萬U以預(yù)防感染。各組于再灌注后3 h及24 h分批處死。根據(jù)處死時間各組再分為2個亞組，進行行為學(xué)評分、腦梗死體積測定，腦切片行MAP2免疫熒光染色檢測。結(jié)果66只大鼠術(shù)后全部存活。再灌注3 h時間點，ARG組和NG組大鼠Longa評分與MCAO模型組相比，差異均有顯著性（P＜0．05）；再灌注24 h時間點，TTC染色顯示，2個介入給藥組與 MCAO模型組相比，差異均有顯著性（P＜0．05）；再灌注3 h和24 h兩個時間點，NG組、ARG組分別與MCAO模型組相比，MAP－2陽性細胞平均光密度均明顯降低（P＜0．05）。結(jié)論腦缺血早期給予NO前體／供體，可能通過抑制MAP－2降解、修復(fù)大量細胞骨架結(jié)構(gòu)，起到腦保護作用。

一氧化氮前體／供體；介入；大腦中動脈栓塞模型；微管相關(guān)蛋白2；大鼠；作用機制

急性大血管閉塞是缺血性腦梗死中最危及生命和致殘的一種類型，常規(guī)治療多選擇組織型纖溶酶原激活劑（rt－PA）或行血管內(nèi)血栓切除術(shù)治療，后者是目前治療顱內(nèi)大血管急性閉塞（ELVO）的新舉措、新標準，能確保血管再通和缺血區(qū)再灌注[1－3]，但仍需其他藥物在血管再通后行輔助治療。如能對缺血靶點進行直接給藥，避免全身性副反應(yīng)將是理想選擇[4]。一氧化氮（NO）除有抗血管痙攣、抗血小板聚集、抗炎性細胞黏附等作用外，還有明確的抗興奮毒性腦損害作用。本研究中通過介入方式對大腦中動脈栓塞（MCAO）模型動物梗死靶點直接給藥，然后根據(jù)行為學(xué)評分、腦組織中微管相關(guān)蛋白2（MAP－2）表達變化的檢測結(jié)果，判斷NO前體／供體（硝酸甘油／精氨酸）對腦損傷的保護作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1．1 動物、試藥與儀器

動物：健康雄性SD大鼠（動物合格證號為42000900000481）66 只，體質(zhì)量 250～300 g，湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)條件為，溫度20～25℃，相對濕度40% ～60%，飼料由該動物實驗中心提供，大鼠自由飲水，自由活動。本研究實驗方案經(jīng)過實驗動物倫理委員會審核。

試藥：小鼠抗微管相關(guān)蛋白－2單克隆抗體（monoclonal Anti－MAP2，Millipore Chemicon 公司）；山羊抗小鼠IgG多克隆抗體，封閉血清（武漢博士德生物公司）。

儀器：Champion Image HPIAS－1000型圖像分析系統(tǒng)。

1．2 建模及分組方法

按隨機化原則將大鼠分為假手術(shù)（sham）組（n＝12）、標準大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO）組（n＝18）、硝酸甘油（NG）組（n＝18）和精氨酸（ARG）組（n＝18）。sham組僅進行手術(shù)，不造成缺血事實。其余組采用Zea－Longa改良法線栓法制作成MCAO模型，缺血2 h后再灌注即刻介入給藥，其中MCAO組給予生理鹽水（0．5m L ／kg），NG 組給予硝酸甘油注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字H44020569，規(guī)格為每支1 m L ∶5 mg）0．06 mL ／kg＋ 生 理鹽水（0．44 mL ／kg），ARG組給予鹽酸精氨酸注射液（天津金耀氨基酸有限公司，國藥準字 H12020999，規(guī)格為每支 20 mL∶5 g）0．12 m L ／kg ＋ 生理鹽水（0．38 m L ／kg）。各組大鼠術(shù)后立即肌肉注射注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，規(guī)格為每支100萬U）6萬U，以預(yù)防感染。各組于再灌注后3 h及24 h分批處死，再分為2個亞組：前者均為6只（用于行為學(xué)評分，組織切片免疫熒光MAP－2標記染色），后者除sham組為6只外其余組均為12只（用于行為學(xué)評分，組織切片免疫熒光MAP2標記染色及TTC染色）。

1．3 觀察指標

神經(jīng)行為學(xué)評分：大鼠完全清醒后，由兩名研究者對大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)觀察，并按Longa 5分制評分標準[5]對各組動物在造模后缺血再灌注3 h及24 h后進行運動行為評分。評分標準：無神經(jīng)損傷記0分；左前肢伸展障礙記1分；向左打圈記2分；行走時向左側(cè)傾倒記3分；意識昏迷記4分；死亡記5分。

腦梗死體積及MAP－2陽性細胞平均光學(xué)密度：大鼠迅速斷頭取腦、制作切片，對腦切片進行TTC染色，測出各區(qū)腦梗死面積，根據(jù)公式梗死體積＝[左側(cè)半球體積－（右側(cè)半球體積－蒼白區(qū)體積）]／全腦體積，算出梗死體積百分比。

MAP－2陽性細胞平均光學(xué)密度：采用Champion Image HPIAS－1000型圖像分析系統(tǒng)測定。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 22．0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。TTC染色和MAP－2染色數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，行t檢驗，各組評分用秩和檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 行為學(xué)評估

結(jié)果見表1。

2．2 梗死體積

表1 各組動物缺血－再灌注3 h及24 h后的Longa評分情況（只）

結(jié)果見圖1和表2。在缺血－再灌注24 h時間點，TTC染色顯示，2個介入給藥組蒼白區(qū)（缺血區(qū)）明顯減小；定量檢測顯示，2個介入給藥組梗死體積較MCAO組顯著減少（P＜0．05）。

圖1 24 h時各組大鼠腦組織切片TTC染色圖

表2 TTC染色各組大鼠大腦梗死體積（±s，%，n＝18）

表2 TTC染色各組大鼠大腦梗死體積（±s，%，n＝18）

組別MCAO組NG組ARG組梗死體積23．01 ± 4．078．00 ± 0．9810．49 ± 1．16

2．3 M AP2 光密度

結(jié)果見表3。缺血－再灌注3 h后，MAP2呈細長條索狀骨架結(jié)構(gòu)，且 MCAO組、NG組及 ARG組大鼠MAP2免疫染色強度與sham組相比明顯減弱。NG組、ARG組與MCAO模型組比，染色強度顯著增強（P＜0．05），提示大腦中動脈閉塞后，細胞骨架結(jié)構(gòu)會坍塌、壞死，而NG／ARG抑制MAP2的降解，維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性。缺血－再灌注24 h后，sham組大鼠腦組織皮層和海馬CA1，CA3區(qū)可見大量細長條索狀骨架結(jié)構(gòu)，排列規(guī)則；與sham組相比，MCAO組大鼠腦組織皮層和海馬CA1，CA3區(qū)幾乎無陽性顯色，提示細胞骨架結(jié)構(gòu)坍塌壞死程度進一步加深，差異顯著（P＜0．05）；和MCAO組相比，NG組、ARG組陽性細胞數(shù)量增加，免疫染色強度增強（P＜0．05）。NG組、ARG組大鼠腦組織皮層和海馬CA1，CA3區(qū)均可見綠色細長條索狀結(jié)構(gòu)，排列規(guī)則，提示大量細胞骨架結(jié)構(gòu)修復(fù)。

表3 各組大鼠MAP2在大腦皮層、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)陽性細胞的光學(xué)密度（±s）

表3 各組大鼠MAP2在大腦皮層、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)陽性細胞的光學(xué)密度（±s）

注：與 sham 組相比，＃P＜0．05；與 MCAO 組相比， P＜0．05。

組別 大腦皮層 大腦海馬CA1區(qū) 大腦海馬CA3區(qū)sham 組（n＝12）MCAO 組（n＝18）NG 組（n＝18）ARG組（n＝18）缺血－再灌注3 h 0．46 ± 0．031．10 ± 0．03＃0．60 ± 0．04＃0．62 ± 0．07＃缺血－再灌注24 h 0．46 ± 0．031．02 ± 0．04＃0．70 ± 0．03＃0．74 ± 0．06＃缺血－再灌注3 h 0．49 ± 0．071．08 ± 0．08＃0．63 ± 0．04＃0．69 ± 0．07＃缺血－再灌注24 h 0．48 ± 0．041．12 ± 0．06＃0．73 ± 0．05＃0．75 ± 0．05＃缺血－再灌注3 h 0．51 ± 0．061．10 ± 0．11＃0．62 ± 0．05＃0．66 ± 0．09＃缺血－再灌注24 h 0．47 ± 0．051．11 ± 0．07＃0．71 ± 0．04＃0．76 ± 0．06＃

3 討論

腦血管病具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率和高復(fù)發(fā)率4大特點，其中80%為缺血性卒中，且大部分患者遺留有不同程度的神經(jīng)功能障礙，給社會和家庭帶來非常沉重的負擔(dān)。有研究者提出，通過動脈介入（intraarterial，IA）方式直接向再通大腦血管遞送神經(jīng)保護類化合物是臨床治療急性缺血性卒中的下一個合乎邏輯的步驟。該研究者還對比了大腦中動脈直接給藥與常規(guī)給藥方式在MCAO模型動物中的療效及安全性，發(fā)現(xiàn)動脈內(nèi)直接給藥耐受性良好，靶向性強，梗死體積減少顯著，神經(jīng)元存活和功能改善增加顯著，無死亡及系統(tǒng)性不良反應(yīng)等優(yōu)點[4－5]。NO前體／供體相關(guān)的臨床藥物較多，其中NG／ARG是最為人所知用于治療缺血性心臟病的血管擴張劑，目前已開始研究其在缺血性卒中中的潛在治療益處，包括降低血壓、促進再灌注及神經(jīng)保護作用[6－9]。鑒于高濃度的NO可能對腦組織產(chǎn)生毒性，臨床難以直接評估NG／ARG在急性缺血性卒中患者中的安全性和有效性，研究更多地局限于動物水平[10－14]。如Maniskas等[11]檢測到，中腦動脈閉塞后施用硝酸甘油GTN 1 d后，組織學(xué)檢測到的梗死體積顯著降低，神經(jīng)元特異性核蛋白NeuN含量顯著升高。Awooda等[12]也發(fā)現(xiàn)，通過腹膜內(nèi)注射 L－精氨酸甲酯（L－NAME）處理能顯著改善大鼠腦缺血－再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損及總抗氧化能力。但目前尚未發(fā)現(xiàn)介入給予NO前體／供體處理對急性缺血性卒中的作用研究。

本研究中構(gòu)建了MCAO大鼠模型，通過IA給藥方式檢測NO前體／供體（NG／ARG）對卒中的腦保護效應(yīng)及在缺血性卒中模型中作為輔助治療的潛力。行為學(xué)結(jié)果顯示，ARG組、NG組缺血－再灌注3 h后Longa評分與MCAO組相比均存在顯著性差異（P＜0．05），提示從行為學(xué)上可觀察到腦保護作用；TTC染色結(jié)果顯示，與MCAO模型組相比，ARG組和NG組缺血再灌注24 h后，蒼白區(qū)明顯減小，系統(tǒng)定量檢測各組動物腦梗死體積，結(jié)果ARG組、NG組與MCAO組相比，差異均有顯著性（P＜0．05），提示 ARG和NG可減少腦缺血體積，增強腦保護作用。

MAP－2屬于結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族，是腦組織中較豐富的蛋白質(zhì)，主要分布于神經(jīng)元胞體、樹突及樹突棘，可同微管蛋白形成微管，聯(lián)同其他結(jié)構(gòu)元件如微絲、肌動蛋白等作用構(gòu)成細胞骨架，也可與突觸后膜受體及信號蛋白相連，是多種神經(jīng)信號傳導(dǎo)通路的底物。神經(jīng)元中MAP－2的丟失或含量降低，常涉及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞及功能發(fā)揮障礙，MAP－2與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性、形態(tài)和功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)。H?rtig[15]發(fā)現(xiàn)，無論是大鼠卒中模型、小鼠卒中模型還是卒中患者自體樣本，均能發(fā)現(xiàn)缺血發(fā)生后缺血區(qū)域微管相關(guān)蛋白tau與MAP－2的免疫反應(yīng)性降低。本研究中免疫組化結(jié)果顯示，MAP－2在 sham組大鼠腦組織皮層和海馬 CA1、CA3區(qū)均呈陽性表達，可見細長條索狀骨架結(jié)構(gòu)；而MCAO組動物的MAP－2免疫染色強度與sham組相比明顯減弱，且隨時間延長，減弱趨勢更明顯；NG組和ARG組免疫染色強度較MCAO組顯著增強，說明經(jīng)IA介入給予NG和ARG治療可抑制MAP－2降解，具有明顯的減少神經(jīng)元脫失，修復(fù)細胞骨架結(jié)構(gòu)，減輕病理損害，挽救神經(jīng)細胞死亡的腦保護作用。

急性缺血性卒中的治療旨在避免死亡并盡量減少功能障礙。雖然本研究中未見動物死亡，初步顯示了IA給藥方式及NG和ARG的安全性，但研究中也發(fā)現(xiàn)一些意外事件，如NG急性IA介入給藥會引起部分MCAO模型大鼠嚴重的行為學(xué)毒性反應(yīng)，給藥后動物經(jīng)常出現(xiàn)短暫抽搐、四肢持續(xù)性抖動，個別動物出現(xiàn)昏迷、醒后精神狀態(tài)差的現(xiàn)象。推測可能與NG代謝迅速、起效快、擴血管作用強烈相關(guān)，繼而增高模型鼠顱內(nèi)壓，而其他器官血流灌注減少，出現(xiàn)全身血壓下降等不良反應(yīng)。因此，有關(guān)NG／ARG在缺血性卒中神經(jīng)藥理學(xué)中的功效及機制仍需要進一步研究。

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Effect of NO Precursor／Donor on Cerebral Ischemia

Zhou Peiyang，Ren Zijing，Sun Chenglin，Liu Guangzhi，Yao Xuan，Cao Zhihua，Wang Pu，Gao Ping
（ Department of Neurology， Xiangyang First People′s Hospital Affiliated to Hubei Medical College， Xiangyang， Hubei， China 441000）

Objective T observe the protective effect of NO precursor ／donor on stroke－induced brain injury in rats，and detect the effect of middle cerebral artery occlusion（MCAO） on the expression of MAP－2 in the brain tissue of rats．Methods Totally 66 SD rats were randomly divided into four groups：sham operation group（sham group， n ＝ 12）；MCAO model group（MCAO group， n ＝ 18），nitroglycerin treatment group（NG group， n ＝ 18），arginine treatment group（ARG group， n ＝ 18）．Sham group was only underwent surgery without causing ischemia．In the other groups，the MCAO models were made by Zea－Longa modified normal embolus．After 2 h of is-chemia，reperfusion was immediately taken into the administration．Rats in each group were immediately intramuscular injected with Benzylpenicillin Sodium for Injection 60000 U to prevent infection．After 3，24 h of reperfusion，rats in each group were killed in batches，each group was divided into two subgroups according to the different sacrificed time point．Longa score was recorded at different time points．Infarct volume was assessed by TTC．The expression of MAP－2 in each group rats brain tissue slices was detected by im-munofluorescence staining．Results All of the 66 rats survived．At 3 h after reperfusion，the Longa scores in ARG group and NG group were significantly different from those in MCAO group（P＜0．05）．At 24 h after reperfusion，the results of TTC staining in the ARG group and NG group had significant difference from those in MCAO group（P＜0．05）．At 3，24 h after reperfusion，the mean optical density of MAP－2 positive cells in NG group and ARG group were significantly lower than those in MCAO group（P＜0．05）．Conclusion NO precursor／donor in the early stage of cerebral ischemia may play a role in brain protection by inhibiting the degradation of MAP－2 and repairing a large number of cytoskeleton structures．

NO precursor／donor；intervention；MCAO model；MAP－2；rat；mechanism

湖北省科學(xué)技術(shù)研究計劃指導(dǎo)性項目[B2015483]；湖北省襄陽市科技計劃研究與開發(fā)項目[襄科計〔2014〕11號]。

周佩洋，博士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病臨床研究，（電子信箱）13597491119＠126．com。

高平，博士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)影像與臨床研究，（電子信箱）43825009＠qq．com。

R965．2

A

1006－4931(2017)24－0004－04

10．3969 ／j．issn．1006－4931．2017．24．002

2017－08－16；

2017－09－26)