小鼠細(xì)胞差異表達(dá)蛋白SWATH定量方法的建立

胡 家 李慎濤 王勁松 李 蕾 殷愛紅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

·技術(shù)方法·

小鼠細(xì)胞差異表達(dá)蛋白SWATH定量方法的建立

胡 家1李慎濤1王勁松2李 蕾1殷愛紅1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

在生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究中，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法已成為一種強有力的工具[1-2]，目前，比較主流的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方案是使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(liquid chromatograph with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)，一次實驗可鑒定到上萬種蛋白質(zhì)。在發(fā)現(xiàn)蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域，穩(wěn)定同位素標(biāo)記和無標(biāo)記相對定量的方法已被廣泛用于差異蛋白表達(dá)譜研究[3-4]，特別在最近一段時期，由于高分辨定量蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，一種基于數(shù)據(jù)非依賴采集(data-independent acquisition，DIA)模式的無標(biāo)記定量方法，即SWATHTM(sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions)定量已成為新興的強大定量工具[5]。

本實驗中，提取實驗組和對照組小鼠骨髓細(xì)胞樣品蛋白質(zhì)，進行基于超濾輔助樣品制備(filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP)，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行蛋白質(zhì)鑒定，結(jié)合SWATHTM質(zhì)譜采集技術(shù)，通過相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)，建立了一種對小鼠骨髓細(xì)胞樣品進行無標(biāo)記差異定量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1)實驗樣品：以2月齡的小鼠骨髓細(xì)胞為對照組，18月齡的小鼠骨髓細(xì)胞為實驗組，兩種細(xì)胞均由本實驗室提供。

2)主要試劑和儀器：尿素、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)和碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)(Sigma公司，美國)；10 000超濾濃縮管(Millipore公司，美國)；胰蛋白酶(Promega公司，美國)；水、乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸(Fisher公司，美國)。SpeedVac真空干燥機(Thermo公司，美國)；Easy-Nano LC液相色譜儀和Triple TOF6600質(zhì)譜儀(Sciex公司，美國)；NanoDrop微量分光光度計(Thermo公司，美國)。

1.2 小鼠細(xì)胞蛋白質(zhì)提取

[6-7] 的方法，向細(xì)胞沉淀中加入5倍體積的裂解液[含20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT和蛋白酶抑制劑]，渦旋均勻，置于冰上裂解細(xì)胞2 h，期間用超聲破碎細(xì)胞(功率2 W、超聲時間2 s、間歇2 s、20個循環(huán))，使樣品溶液澄清。將樣品置于高速離心機中4 ℃、40 000 g離心1 h。取離心上清、分裝、保存于-80 ℃，用NanoDrop微量分光光度計對裂解細(xì)胞總蛋白質(zhì)進行定量。

1.3 細(xì)胞蛋白質(zhì)酶切

按參考文獻(xiàn)[8]的方法，各取200 μg實驗組和對照組蛋白質(zhì)樣品，加入DTT至終濃度10 mmol/L，37 ℃孵育2.5 h，使樣品中蛋白質(zhì)的二硫鍵處于打開狀態(tài)，恢復(fù)至室溫，加入碘乙酰胺至終濃度50 mmol/L，避光放置40 min，對打開的二硫鍵進行烷基化保護。將樣品轉(zhuǎn)移至截留相對分子質(zhì)量為10 000的超濾濃縮管中，10 000 g、20 ℃離心30 min，在超濾管中加入200 μL裂解液，10 000 g、20 ℃離心30 min，重復(fù)本步驟2～3次，徹底去除十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sutfate,SDS)等去污劑。在超濾管中加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3，10 000 g、4 ℃離心30 min，重復(fù)本步驟2～3次。換一個新的超濾管套管，在內(nèi)管中加入150 μL 50 mmol/L NH4HCO3，再按照 蛋白：Trypsin=50∶1的比例加入酶液，37 ℃孵育16 h。10 000 g、4 ℃離心30 min，加入100 μL 50 mmol/L NH4HCO3，10 000 g、4 ℃離心30 min，重復(fù)該步驟3次，收集多肽樣品。最后，向樣品中加入終濃度1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸，凍干樣品。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用方法

將酶切樣品用A相溶液[含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸及2%(體積分?jǐn)?shù))乙腈]重溶后，經(jīng)NanoDrop定量，18 000 g離心10 min，取4 μL上清進行納升級液相與Triple TOF 6600質(zhì)譜聯(lián)用分析。色譜柱：C18除鹽柱(3 μm，120 ?，350 μm×0.5 mm)、C18分析柱(3 μm，120 ?，75 μm×150 mm)，柱溫為40 ℃，系統(tǒng)柱壓小于6 000 Psi；流速：300 nL/min；1 h分析梯度：0 min，5%(體積分?jǐn)?shù))B[B相溶液：含0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸及98%(體積分?jǐn)?shù))乙腈]；0～0.1 min，5%～9% B；0.1～32 min，9%～22% B；32～48 min，22%～32% B；48～51 min，32%～40% B；51～51.1 min，40%～80% B；51.1～56 min，80% B；56～56.1 min，80%～5% B；56.1～60 min，5% B。質(zhì)譜條件：ESI源、正離子掃描模式、噴霧電壓2.3 kV、離子源溫度150 ℃。蛋白質(zhì)鑒定質(zhì)譜掃描模式：一級全掃描，質(zhì)荷比(mass to charge,m/z)范圍350～1 500；二級挑選40個強度高的前體離子進行誘導(dǎo)碰撞解離(collision induced dissociation,CID)；掃描范圍m/z 100～1 500，動態(tài)排除掃描，動態(tài)排除時間10 s。SWATH蛋白質(zhì)定量模式：一級全掃描，m/z范圍350～1 500；二級掃描窗口根據(jù)蛋白質(zhì)鑒定的液相TIC圖在m/z 400～1 225的范圍設(shè)置了60個可變二級掃面窗口，在前體離子密集時，使用窄質(zhì)量數(shù)窗口，增強選擇性，在前體離子密度較低時，使用寬質(zhì)量數(shù)窗口，以覆蓋更廣泛的前體離子；CID動態(tài)碎裂，依次均勻掃描。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Sciex提供的搜索引擎“Protein Pilot Software 5.0”對鑒定模式所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進行搜索，使用Uniprot Mus musculus數(shù)據(jù)庫(更新于2016年8月)，設(shè)置一級質(zhì)量偏差10 ppm、二級質(zhì)量偏差20 ppm，獲得置信度較高(假陽性率<1%)的譜圖庫。利用PeakView2.2軟件提取數(shù)據(jù)依賴采集方式(data dependent analysis,DDA)建立的譜圖庫中的母離子和碎片離子的保留時間，對相應(yīng)SWATH產(chǎn)生碎片離子的保留時間進行匹配，提取相應(yīng)肽段的碎片離子色譜峰，并根據(jù)色譜峰的強度和保留時間積分計算峰面積。PeakView2.2軟件中設(shè)定條件如下：每種蛋白質(zhì)包含肽段數(shù)至少為10且是特有肽段;每種肽段的碎片離子(transition)為6;假陽性率設(shè)為10%;提取窗口6 min;在不同的洗脫時間內(nèi)，選取豐度、峰形較好的肽段對其他肽段進行保留時間的校正。結(jié)果以報告的形式輸出，其中包含碎片離子峰面積、肽段峰面積和組裝成相應(yīng)蛋白的峰面積。采用MarkView1.2軟件對數(shù)據(jù)進行差異分析，P>0.05可接受，t檢驗得出差異2倍以上的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 建立SWATHTM圖譜采集方法及小鼠細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)離子文庫(ion library)

對實驗組和對照組2個樣品進行了酶切，將酶切后各樣品等量混合，上樣量為800 ng，進行60 min梯度液相色譜，質(zhì)譜用數(shù)據(jù)依賴采集模式(DDA-MS)。采集結(jié)束后，依據(jù)本次實驗的液相總離子流圖(total ions chromatograph,TIC)(圖1)確定樣品合適的液相分離梯度，并在質(zhì)荷比(m/z)400至1 225之間設(shè)置60個SWATHTM采集可變窗口，如圖2，在前體離子密集時，使用窄質(zhì)量數(shù)窗口，增強選擇性，在前體離子密度較低時，使用寬質(zhì)量數(shù)窗口以確保覆蓋更廣泛的前體離子。通過可變窗口的設(shè)置，期望采集到檢測范圍內(nèi)所有前體離子和二級產(chǎn)物離子信息。由此建立本次實驗的SWATHTM采集方法。

圖1 蛋白質(zhì)鑒定液相總離子流圖(TIC)Fig.1 Total ions chromatograph (TIC) of protein identification

圖2 設(shè)置60個SWATHTM采集窗口Fig.2 Set 60 SWATHTM acquisition windows

The blue line represents the ion density,the orange line represents the width of the variable windows；SWATHTM：sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions；m/z:mass to charge.

SWATHTM定量是一種質(zhì)譜數(shù)據(jù)非依賴采集模式(DIA-MS)，并依賴二級質(zhì)譜信息對蛋白質(zhì)進行定量的方法。DDA-MS采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高，但SWATHTM采集的數(shù)據(jù)信息比DDA-MS要豐富一些[9]，因此通過DDA-MS采集數(shù)據(jù)建立SWATHTM定量的蛋白質(zhì)離子文庫，并且為了確保SWATHTM定量分析不遺漏數(shù)據(jù)信息，將多次DDA-MS采集的小鼠樣品數(shù)據(jù)一并通過ProteinPilot軟件(Sciex)搜索Uniprot的Mus musculus蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，共鑒定到3 043種蛋白質(zhì)，將這些蛋白質(zhì)多肽的二級質(zhì)譜信息和液相離子保留時間構(gòu)建成本次SWATHTM定量的蛋白質(zhì)離子文庫。

2.2 SWATHTM采集

調(diào)用已建立的SWATHTM采集方法，每個樣品進3針，圖3為2個樣品的3次重復(fù)進樣TIC圖，橫坐標(biāo)為質(zhì)譜采集時間、縱坐標(biāo)為樣品離子強度，彩色曲線為2個樣品各重復(fù)3次進樣的總離子流圖?？梢姌悠分貜?fù)性好，且質(zhì)譜檢測離子強度高、出峰很多，樣品制備和液相分離效果理想。

2.3 差異蛋白質(zhì)鑒定

將SWATHTM數(shù)據(jù)經(jīng)過PeakView2.2及MarkView1.2軟件分析，共鑒定到97種顯著表達(dá)差異2倍以上的蛋白質(zhì)，如圖4，其中上調(diào)蛋白質(zhì)43種，其中上調(diào)3倍以上的蛋白質(zhì)有15種；下調(diào)蛋白質(zhì)54種，其中下調(diào)0.3倍以上的蛋白質(zhì)有16種，變化越明顯說明蛋白質(zhì)表達(dá)差異越大。經(jīng)過蛋白質(zhì)功能分析顯示，鑒定的這些差異蛋白有一些與細(xì)胞衰老有關(guān)。本文重點介紹實驗方法，涉及所鑒定蛋白的具體數(shù)據(jù)將在另一篇文章詳細(xì)描述。

圖3 SWATHTM采集兩個樣品3次重復(fù)進樣的TIC圖Fig.3 TIC of 3 repeated injections of 2 samples with SWATHTM MSTIC：total ions chromatograph；MS:mass spectrometry.

圖4 SWATHTM定量兩個樣品的差異表達(dá)蛋白數(shù)Fig.4 Differentially expressed proteins identified by SWATHTM MSMS:mass spectrometry；SWATHTM：sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions.

3 討論

SWATHTM技術(shù)通過均勻掃描和采集檢測范圍內(nèi)所有前體離子及二級產(chǎn)物離子信息，并依據(jù)二級產(chǎn)物離子峰面積進行蛋白質(zhì)定量，能有效規(guī)避DDA定量模式中由于高豐度信號影響和動態(tài)排除等引起的定量靈敏度不高和重現(xiàn)性差等問題，同時提高了高分辨質(zhì)譜的定量通量[10-11]。SWATHTM技術(shù)自2012年推出以來，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。Huang等[12]用SWATHTM采集方法對鼠細(xì)胞裂解液蛋白質(zhì)組進行分析，在沒有進行樣品預(yù)分離的條件下，鑒定到3 600種蛋白質(zhì)，并對這些蛋白質(zhì)進行了絕對定量。Lambert 等[13]利用親和純化結(jié)合SWATHTM技術(shù)(AP-SWATHTMMS)研究蛋白質(zhì)相互作用，能夠特異性地富集到靶蛋白的相互作用蛋白，實現(xiàn)了復(fù)合蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定。Sidoli等[14]采用重標(biāo)同位素標(biāo)記組蛋白翻譯后修飾多肽，再用SWATHTM定量分析，檢測到組蛋白H3多肽豐度差異極大，跨越了4個數(shù)量級。由此可見TripleTOF質(zhì)譜儀搭配SWATHTM采集模式分析樣品，可以全面、準(zhǔn)確定量分析所獲得的二級質(zhì)譜信息，在高通量蛋白質(zhì)組學(xué)層面實現(xiàn)了與針對特定蛋白質(zhì)定量質(zhì)譜技術(shù)(如SRM等)相當(dāng)?shù)亩磕芰10,15]。

本實驗以兩個樣品為例，介紹了一種大規(guī)模非標(biāo)定量蛋白質(zhì)的方法。通過對實驗組和對照組樣品進行FASP酶切，建立SWATHTM采集方法，對樣品各進行3次SWATHTM采集，通過軟件分析實驗結(jié)果，可一次性對兩組樣品的幾千種差異蛋白質(zhì)進行定量分析。該實驗流程適用于多組樣品的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，比如不同時間點、不同藥物、不同濃度試劑處理的樣品等等，由于版權(quán)所限不在此展示。

實驗流程中應(yīng)用的高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)Triple-TOF 6600，搭載SWATHTM2.0采集技術(shù)，掃描速度快且質(zhì)量數(shù)窗口可變。在前體離子密集時，使用窄質(zhì)量數(shù)窗口，增強選擇性，在前體離子密度較低時，使用寬質(zhì)量數(shù)窗口，以覆蓋更廣泛的前體離子。與傳統(tǒng)的LC-MS/MS系統(tǒng)方案相比，SWATHTM采集模式能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)所有的肽段母離子經(jīng)過超高速掃描并進行二級碎裂，從而獲得完整的肽段信息。在對大規(guī)模蛋白質(zhì)進行定量分析時，無需對樣品進行預(yù)分離和標(biāo)記，一次實驗?zāi)軐崿F(xiàn)多組樣品中幾千種蛋白質(zhì)的相對定量，省時省力并節(jié)省實驗成本。

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*Corresponding author，E-mail：yinhong87@sina.com

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.036.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.031]

2017-03-24)

編輯 陳瑞芳