楊梅素潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制計(jì)算機(jī)虛擬篩選研究

何侃亮，李 博，袁秋貞

陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安710003)

楊梅素潛在作用靶點(diǎn)及機(jī)制計(jì)算機(jī)虛擬篩選研究

何侃亮，李 博，袁秋貞△

陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(西安710003)

目的：探討楊梅素發(fā)揮藥理活性的作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制。方法：利用Pharmmapper及DRAR-CPI平臺分別預(yù)測楊梅素潛在作用靶點(diǎn)，對所得靶蛋白進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘分析；用STRING平臺對預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得靶蛋白的注釋、蛋白互作信息并進(jìn)行通路富集分析。結(jié)果：楊梅素發(fā)揮抗癌作用的潛在作用靶點(diǎn)可能為Pim-1、EGFR，此外還與PI3K-Akt及MAPK通路有關(guān)。討論：楊梅素可能通過膽堿酯酶和β-分泌酶，以及影響Neurotrophin、ErbB通路發(fā)揮改善認(rèn)知功能及抑郁樣行為的作用。

楊梅素(3，5，7，3'，4'，5'，-六羥基黃酮，Myricetin)又名楊梅樹皮素，是黃酮醇類化合物，常見于茶葉、漿果以及草藥中。近年來隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)楊梅素具有抗癌、保護(hù)神經(jīng)、抗氧化、抗炎等多種藥理學(xué)活性[1]。眾多研究表明，楊梅素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長、增殖及侵襲的作用，同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎等作用[2-3]。計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)是指利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行理論計(jì)算，以減少采用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)手段篩選藥物的工作量，提高新藥研發(fā)成功的概率，主要包括虛擬篩選和藥效團(tuán)設(shè)計(jì)[4]。通常從天然中草藥中分離得到的單體化合物可能具有藥理學(xué)作用，但是需要大量細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證或排除，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；另一方面，某些已經(jīng)上市銷售多年的藥物，因?yàn)閷ζ浞肿影袠?biāo)的認(rèn)識程度不夠，而沒有認(rèn)識到它的其他不良反應(yīng)或者新作用。因此采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選技術(shù)對天然產(chǎn)物進(jìn)行研究十分有必要。為了探討楊梅素的藥理學(xué)效應(yīng)，本研究將基于計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法，利用Pharmmapper和DRAR-CPI平臺獲得楊梅素可能的作用靶點(diǎn)，采用String平臺對楊梅素的預(yù)測靶蛋白之間的相互作用進(jìn)行分析，報(bào)告如下。

材料與方法

1 楊梅素分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和準(zhǔn)備 在SybylX2.0軟件中構(gòu)建楊梅素分子(圖1A)，并對其進(jìn)行預(yù)處理，對分子構(gòu)象加載Gasteiger-Huckel電荷，采用Tirpos力場Minimize程序進(jìn)行能量最小化，以最大次數(shù)1000，0.001kcal/mol作為收斂標(biāo)準(zhǔn)的Powel能量梯度法進(jìn)行優(yōu)化，得到穩(wěn)定構(gòu)象。

2 楊梅素潛在靶點(diǎn)預(yù)測 將楊梅素分子的mol2格式文件提交到Pharm mapper數(shù)據(jù)庫，選擇人類蛋白靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。Pharm mapper將對配體小分子和數(shù)據(jù)庫中的藥效團(tuán)自動匹配，按照匹配分值 (fitscore)的大小輸出分析結(jié)果。將楊梅素分子的mol2格式文件提交到服務(wù)器，平臺運(yùn)算后下載計(jì)算結(jié)果進(jìn)行分析。服務(wù)器建議選取藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用(chemical-protein)的Z-score<-0.5納入為潛在靶點(diǎn)。

3 潛在作用靶點(diǎn)的生物過程和代謝通路分析 將篩選所得楊梅素靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺，經(jīng)平臺進(jìn)行分析獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用，以及蛋白質(zhì)的生物功能注釋。通過提供PubMed相關(guān)信息摘要以及鏈接NCBI等其他數(shù)據(jù)庫對蛋白靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，如根據(jù)染色體臨近、基因融合、基因共表達(dá)等多方面對結(jié)果進(jìn)行綜合評分，并根據(jù)分?jǐn)?shù)高低對相關(guān)蛋白進(jìn)行排序。同時(shí)，應(yīng)用STRING進(jìn)行靶蛋白的GO分析及KEGG信號通路富集分析。

結(jié) 果

1 基于Pharmapper的靶點(diǎn)預(yù)測 利用Pharm mapper對其數(shù)據(jù)庫的7000余靶蛋白進(jìn)行運(yùn)算，結(jié)果按照Fit Score從大到小進(jìn)行排序。得分排名前30的疾病相關(guān)蛋白靶點(diǎn)信息(圖1)。配體與各靶蛋白的藥效團(tuán)匹配情況(圖2)。

圖1 構(gòu)建楊梅素分子及排名前30的疾病相關(guān)蛋白靶點(diǎn)信息

圖2 楊梅素與靶蛋白藥效團(tuán)疊合圖

2 基于DRAR-CPI的靶點(diǎn)預(yù)測 DRAR-CPI結(jié)果中，依據(jù)Chemical-protein打分值共有98個(gè)蛋白靶點(diǎn)。楊梅素可能的作用靶點(diǎn)中，涉及細(xì)胞過程、代謝過程、免疫系統(tǒng)的靶點(diǎn)較多，如MAPK、TNK2、CDK2、PPAR等，我們進(jìn)一步針對楊梅素與這幾個(gè)蛋白的關(guān)系進(jìn)行探討，DRAR-CPI平臺提供了楊梅素分子與靶蛋白的分子對接結(jié)果(圖3)。結(jié)果顯示，楊梅素與MAPK1的Docking Score為-43.8814，Z-Score為-1.80118，表明楊梅素與MAPK1可能有較好的結(jié)合；楊梅素與TNK2的Docking Score為-40.3406，Z-Score為-2.15523。相比MAPK1，TNK2的Docking Score值略高，但Z-Score值略低，但均處于小于平臺推薦的-0.5范圍內(nèi)，且對接結(jié)果顯示均有較好的結(jié)合。楊梅素與CDK2的Docking Score為-40.4291，Z-Score為-1.42111，同樣存在較穩(wěn)定的相互作用。以上結(jié)果表明，MAPK1、TNK2、CDK2可能是楊梅素發(fā)揮抗腫瘤活性的潛在重要作用靶點(diǎn)。

圖3 楊梅素與靶蛋白的分子對接情況

3 潛在作用靶蛋白網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 我們使用STRING平臺構(gòu)建了楊梅素靶蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4。圖中共產(chǎn)生76個(gè)節(jié)點(diǎn)和229個(gè)邊，每個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)預(yù)測的靶蛋白，線的顏色代表每種來自不同類型的證據(jù)，提示楊梅素潛在作用靶點(diǎn)間通過多條相互作用通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。從圖中可以看出，MAPK1、EGFR、SRC、AKT1、PRKACA、SYK、NR3C1、GSK3B、PAK、PPAR等位于關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)位置，在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中有著十分重要的地位，提示楊梅素可能通過這些蛋白發(fā)揮其藥理學(xué)活性。

圖4 DRAR-CPI預(yù)測所得靶蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

4 靶點(diǎn)代謝通路分析 為楊梅素預(yù)測靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析。部分通路情況如下：9個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與ErbB信號通路(KEGG ID: 04012),12個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與MAPK信號通路(KEGG ID: 04010)，8個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與Neurotrophin信號通路(KEGG ID: 04722)，10個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與癌癥相關(guān)通路(KEGG ID: 05200)，15個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與NF-κB信號通路(KEGG ID: 04064)，9個(gè)靶點(diǎn)蛋白參與PI3K-Akt信號通路(KEGG ID: 04151)。

討 論

中國知網(wǎng)、Pubmed及Web of Science數(shù)據(jù)庫中研究楊梅素的藥理學(xué)活性，并與虛擬篩選平臺所預(yù)測的靶點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Pharmmapper中得分最高的Pim-1(Z-score=1.05447)是基因Pim家族中的一員，調(diào)控細(xì)胞凋亡、分化、增殖進(jìn)而參與腫瘤形成過程[5]。目前大量證據(jù)表明，楊梅素可劑量依賴性的抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖與轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑，發(fā)揮抗腫瘤作用。EGFR(Z-score=0.664508)是EGFR酪氨酸激酶家族的成員之一，其與配體結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化，引發(fā)自身磷酸化，轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等過程[6]。EGFR在腫瘤細(xì)胞中過度激活狀態(tài)，使細(xì)胞周期失去調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無限制生長。目前EGFR抑制劑已成為臨床腫瘤病人治療的重要藥物，如酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼。預(yù)測結(jié)果提示，楊梅素可能通過調(diào)控Pim-1、EGFR進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，而這一機(jī)制仍需進(jìn)一步利用動物和細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

膽堿酯酶(Z-score=0.645846)作為治療阿爾茨海默癥的重要靶點(diǎn)，被認(rèn)為可影響乙酰膽堿的合成、釋放及攝取進(jìn)從而導(dǎo)致記憶力衰退?；谶@一理論，多奈哌齊、石杉堿甲等乙酰膽堿酶抑制劑已被研制成功并成為目前主要的臨床治療藥物。β-分泌酶(Z-score=0.460382)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，通過在腦內(nèi)切割β淀粉樣蛋白前體蛋白形成β淀粉樣蛋白，參與阿爾茨海默癥的發(fā)生發(fā)展[7]。已有證據(jù)表明，楊梅素在大鼠中可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用，但其涉及的分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。結(jié)合預(yù)測結(jié)果，我們可以認(rèn)為楊梅素可能通過調(diào)控膽堿酯酶以及β-分泌酶的活性，影響下游的乙酰膽堿和β淀粉樣蛋白，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用。

研究表明神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制與Neurotrophin信號通路、ErbB信號通路密切相關(guān)[8]。其中ErbB通路的平衡對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，ErbB4突變小鼠表現(xiàn)出與精神分裂癥小鼠模型相同的行為學(xué)改變[9]。Ma等報(bào)道，給予楊梅素可以改善慢性應(yīng)激后小鼠小鼠抑郁樣行為，上調(diào)海馬組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)水平[10]；Wang等最新研究同樣表明，注射楊梅素可以改善慢性應(yīng)激后小鼠的認(rèn)知障礙，緩解學(xué)習(xí)能力的下降，升高海馬組織BDNF蛋白表達(dá)量。BDNF為Neurotrophin信號通路中重要的上游因子，動物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們虛擬篩選結(jié)果是一致的，表明楊梅素可以通過調(diào)控Neurotrophin信號通路發(fā)揮其保護(hù)神經(jīng)作用。 但楊梅素與ErbB通路的研究目前尚無相關(guān)報(bào)道，這一機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

大量研究表明，楊梅素可通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。PI3K/AKT通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，研究證實(shí)該通路的過度表達(dá)和活化能夠引起腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的異常。Yang等[3]最新研究表明，楊梅素可通過PI3K/AKT通路與MAPK通路，抑制人胎盤絨膜癌細(xì)胞侵襲遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Phillips等研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素可抑制Akt磷酸化，影響PI3K信號通路，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的生長。本研究中通路分析預(yù)測，楊梅素的潛在靶點(diǎn)中9個(gè)參與PI3K-Akt通路。以上結(jié)果提示，楊梅素可以通過調(diào)控PI3K-Akt通路影響腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了細(xì)胞的生長、發(fā)育、分裂死亡以及細(xì)胞間多種生化反應(yīng)信號的識別傳遞過程。本研究中分子對接結(jié)果提示，楊梅素與MAPK1有較好的結(jié)合；靶點(diǎn)通路富集分析顯示，楊梅素潛在作用靶點(diǎn)中有12個(gè)參與MAPK通路。 Kang等人報(bào)道，在鼠肺纖維細(xì)胞中，楊梅素可以通過調(diào)節(jié)MAPK通路發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。Fu等人研究發(fā)現(xiàn)，楊梅素也可以通過抑制MAPK通路的活化，從而降低鼠樹突細(xì)胞的活化水平。結(jié)合本研究預(yù)測結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道可推測，楊梅素通過抑制MAPK通路中ERK、JNK及p38的活化發(fā)揮抗癌作用。

綜上所述，我們利用不同的計(jì)算機(jī)虛擬篩選平臺對楊梅素可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了分析，所得篩選結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道中針對楊梅素的分子機(jī)制研究一致，但仍有較多潛在作用靶點(diǎn)并未被動物或細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)所研究。楊梅素發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，可能與其對膽堿酯酶、β-分泌酶以及Neurotrophin、ErbB信號通路的調(diào)控有關(guān)；而其抗癌作用機(jī)制與重要潛在作用靶點(diǎn)Pim-1、EGFR有關(guān)，此外還可能通過調(diào)控PI3K-Akt、MAPK通路影響癌細(xì)胞生長、增殖及侵襲過程。本研究可為楊梅素發(fā)揮藥理學(xué)活性作用機(jī)制的深入研究提供重要的理論依據(jù)和線索。

[1] Semwal DK,Semwal RB,Combrinck S,etal.Myricetin: A Dietary Molecule with Diverse Biological Activities[J].Nutrients,2016,8(2):90.

[2] Wang QM,Wang GL,Ma ZG.Protective effects of myricetin on chronic stress-induced cognitive deficits[J].Neuroreport,2016,27(9):652-658.

[3] Yang C,Lim W,Bazer FW,etal.Myricetin suppresses invasion and promotes cell death in human placental choriocarcinoma cells through induction of oxidative stress[J].Cancer letters,2017,399:10-19.

[4] Guney E,Menche J,Vidal M,etal.Network-based in silico drug efficacy screening[J].Nature Communications,2016,7:3467-3749..

[5] 孫占莉,肖旭華,袁 博.Pim-1激酶小分子抑制劑的研究進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥,2013,(1)：43-50.

[6] 劉津珠,鄭飛波.人體表皮生長因子受體3研究進(jìn)展[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2013,42(3):368-369.

[7] Meldolesi J.Neurotrophin receptors in the pathogenesis, diagnosis and therapy of neurodegenerative diseases[J].Pharmacological Research,2017,121:129-137.

[8] Jacobi N,Seeboeck R,Hofmann E,etal.ErbB Family Signalling: A Paradigm for Oncogene Addiction and Personalized Oncology[J].Cancers,2017,9(4):167-168.

[9] Silberberg G,Darvasi A,Pinkas-Kramarski R,etal.The involvement of ErbB4 with schizophrenia: association and expression studies[J].American journal of medical genetics. Part B, Neuropsychiatric genetics : the official publication of the International Society of Psychiatric Genetics,2006,141B(2):142-148.

[10] Ma Z,Wang G,Cui L,etal.Myricetin Attenuates Depressant-Like Behavior in Mice Subjected to Repeated Restraint Stress[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(12):28377-28385.

△ 通訊作者

楊梅素 抗腫瘤藥 計(jì)算機(jī)模擬 神經(jīng)保護(hù)

R96

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.003

(收稿：2017-08-20)