基于SNP標(biāo)記桃抗蚜性狀的基因定位

張南南，魯振華，崔國朝，潘磊，曾文芳，牛良，王志強(qiáng)

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基于SNP標(biāo)記桃抗蚜性狀的基因定位

張南南，魯振華，崔國朝，潘磊，曾文芳，牛良，王志強(qiáng)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所/國家桃葡萄改良中心/農(nóng)業(yè)部果樹育種技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450009）

挖掘與桃抗蚜性狀緊密連鎖的SNP位點(diǎn)及候選基因，為桃抗性分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步揭示桃抗蚜性狀的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制提供依據(jù)。以來源于‘粉壽星’的抗蚜桃‘01-77-3’為母本，栽培品種‘中油桃13號’為父本，雜交獲得F1代分離群體進(jìn)行基因定位。以‘96-5-1’（抗蚜）為母本，‘10-7’（感蚜）為父本雜交獲得F1分離群體作為驗(yàn)證定位位點(diǎn)準(zhǔn)確性的材料。參考桃基因組序列（Genome v2.0.a1）開發(fā)基于Sanger測序的SNP標(biāo)記，在親本（‘01-77-3’‘中油桃13號’）及各4個(gè)子代中PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger測序，獲得候選SNP后，擴(kuò)大群體驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)對抗性基因的初步定位。對親本（‘01-77-3’‘中油桃13號’‘96-5-1’‘10-7’）進(jìn)行覆蓋度約為70×的全基因組深度測序，并基于重測序數(shù)據(jù)，在初定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)基于Sanger測序與HRM分析的SNP標(biāo)記，篩選多態(tài)性標(biāo)記，對‘01-77-3’ב中油桃13號’雜交后代141株實(shí)生苗進(jìn)行基因分型，以獲得與桃抗蚜型基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。通過雙親（‘96-5-1’‘10-7’）表型與基因型一致，在精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)與桃抗蚜性狀緊密連鎖的InDel位點(diǎn)，以驗(yàn)證InDel標(biāo)記與抗蚜表型是否連鎖。最后，參考桃基因組分析定位區(qū)間的候選基因。通過人工接種觀察蚜蟲對桃F1后代單株新梢危害表明，抗蚜與感蚜比例接近1﹕1（值為0.556；χ2為0.348），符合孟德爾遺傳規(guī)律?；赟anger測序結(jié)果，初步將抗蚜基因定位在桃基因組Pp01_38011783與Pp01_47231340之間，物理距離約為9.22 Mb。親本全基因組深度測序分別產(chǎn)生Clean data 17.109 Gb，平均覆蓋度為75.19×，在Pp01初定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)基于HRM與Sanger測序的SNP標(biāo)記共29對，篩選后得到11對緊密連鎖的標(biāo)記?；蚍中徒Y(jié)果表明，與桃抗蚜基因緊密連鎖的標(biāo)記位于桃基因組Pp01的45.66 Mb和46.12 Mb處，Pp01_45.66處等位基因?yàn)門和C，Pp01_46.12處等位基因?yàn)镚和C，遺傳距離分別為1.4 cM、2.1 cM；與抗蚜基因完全連鎖的標(biāo)記SNP_Pp01_45712702，位于桃基因組Pp01_45.71處，等位基因?yàn)镚和T?；谟H本（‘96-5-1’‘10-7’）重測序數(shù)據(jù)，在精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)開發(fā)緊密連鎖的InDel標(biāo)記KYYZ_Pp01_45799758，位于Pp01_45.79處。對驗(yàn)證群體92個(gè)單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明，僅1個(gè)單株基因型與表型不符，分子鑒定準(zhǔn)確率為98.91%。利用親本深度測序與SNP標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法，精細(xì)定位了控制桃抗蚜性狀的基因，將抗蚜基因縮小到物理區(qū)間460 Kb內(nèi)，共包含56個(gè)轉(zhuǎn)錄本，包括52個(gè)候選基因。

桃；SNP標(biāo)記；抗蚜；基因定位

0 引言

【研究意義】桃[（L.）Batsch]是中國栽培面積較大的落葉果樹之一。據(jù)2014年統(tǒng)計(jì)中國桃栽培面積799 500 hm2，占世界栽培總面積的53.3%（FAO）。蚜蟲是危害桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要蟲害之一，其危害新梢和幼果，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致葉片卷曲、果實(shí)畸形、品質(zhì)下降、樹體生長勢減弱甚至死亡[1]。發(fā)掘和培育抗蚜品種是防治蚜蟲的重要途徑，利用現(xiàn)有遺傳資源開展相關(guān)抗性基因的定位工作具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蚜蟲為半翅目昆蟲，包含近5 000種，是地球上最大、分布最廣、破壞力最強(qiáng)的植食性昆蟲之一[2]。其繁殖力強(qiáng)，生活周期短，常常在短期內(nèi)就能形成較高的種群密度[3]。據(jù)報(bào)道，桃綠蚜（GPA）具有很強(qiáng)的抗藥性，因?yàn)闅⑾x劑的廣泛使用，使得GPA能抵抗眾多的殺蟲劑[4-6]。法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院（INRA）最先對‘Weeping Flower Peach’（S2678）、‘Rubira?’（S2605）、‘’（P1908）、‘Summergrand’（S39712）和‘Malo konare’（S5392）5種桃抗蚜資源開展了一系列研究工作，發(fā)現(xiàn)桃‘Weeping Flower Peach’和‘Rubira?’具有很強(qiáng)的抗蚜能力，進(jìn)一步研究表明其中有5種抗蚜基因型[7-8]。初步明確了與抗蚜相關(guān)的顯性遺傳機(jī)制，同時(shí)闡明3種不同來源的抗蚜資源抗性機(jī)制不同[9-11]。目前，中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種抗性資源。其中，牛良等[1]對‘粉壽星’抗蚜性的遺傳及其穩(wěn)定性進(jìn)行分析，明確了其抗蚜性狀由一對顯性基因控制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管中國有豐富的抗蚜資源，但相關(guān)遺傳資源的研究和利用起步較晚，且對抗蚜機(jī)制沒有深入研究。基于來源中國重要的抗蚜資源‘粉壽星’，開展抗蚜基因的精細(xì)定位是明確桃抗蚜機(jī)制與遺傳改良的前提?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在明確‘粉壽星’抗蚜遺傳特征的基礎(chǔ)上，繼續(xù)對來源中國‘粉壽星’的桃抗蚜基因進(jìn)行定位。通過獲得與抗蚜基因緊密連鎖的分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)早期對目標(biāo)性狀的分子鑒定，提高育種效率，為桃抗蚜資源的挖掘和抗性品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

田間試驗(yàn)于2014—2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所新鄉(xiāng)試驗(yàn)基地進(jìn)行，其他試驗(yàn)于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所農(nóng)業(yè)部果樹育種技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以‘01-77-3’為母本，來源于‘粉壽星’，具有抗蚜性狀，基因型為Rr；以‘中油桃13號’為父本，感蚜，基因型為rr。2014年4月手工去雄后并人工授粉，獲得雜交后代141株實(shí)生苗作為基因定位群體。另外，以‘96-5-1’（抗蚜，Rr）為母本，‘10-7’（感蚜，rr）為父本，人工去雄授粉，獲得F1分離后代116株實(shí)生苗，用于驗(yàn)證標(biāo)記與抗蚜表型的連鎖性。

1.2 表型鑒定與DNA提取

參考PASCAL等[12]的抗蚜表型鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)確定各單株的抗蚜型和感蚜型。2015年4月上旬將兩群體F1代實(shí)生苗分別放入網(wǎng)室中進(jìn)行接種處理，人工接種混合桃綠蚜10頭后套上小紗網(wǎng)，蚜蟲來自試驗(yàn)園感蚜株，2周后觀察蚜蟲對新梢的危害，確定抗蚜與感蚜表型（圖1）。2016年4月上旬將全部F1代實(shí)生苗分別放入網(wǎng)室中進(jìn)行接種處理，重復(fù)鑒定。

采用改良CTAB法[13]提取親本及F1群體各單株基因組DNA，略作修改。加入100 μL體積的0.1×TE溶解沉淀DNA，同時(shí)加入0.5 μL的RNase，37℃放置1 h，去除RNA污染（長期保存在-20℃冰箱，常用則存于4℃冰箱）；采用NanoDrop 1000 spectrophotometer（Thermo）和1%的瓊脂糖膠對提取的DNA純度、濃度和完整度進(jìn)行檢測，并稀釋成工作液濃度（25 ng?μL-1），用于后續(xù)研究。

左邊為感蚜，右邊為抗蚜 Left:Sensitive type to green aphid, Right:Resistant type to green aphid

1.3 抗蚜基因的初步定位

參考Genome Database for Rosaceae數(shù)據(jù)庫的桃基因組（Genome v2.0.a1）序列，采用primer3 Web Version 4.0（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)引物，引物的退火溫度在60—63℃，長度20—23 bp，開發(fā)基于Sanger測序的SNP標(biāo)記，選擇約每1—2 Mb設(shè)計(jì)1對引物，擴(kuò)增片段長度約為1 600 bp或750 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對親本及各4個(gè)子代（抗蚜型和感蚜型）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（步驟參數(shù)詳見TaKaRa Ex Taq說明書），PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在CExpress軟件中打開，序列對齊后尋找與抗蚜性狀緊密連鎖的SNP標(biāo)記，表現(xiàn)為抗蚜型母本基因型為Rr，感蚜型父本基因型為rr，且子代表型與基因型一致。

1.4 親本深度測序

將檢驗(yàn)合格的親本（‘01-77-3’‘中油桃13號’‘96-5-1’‘10-7’）基因組DNA樣品（無污染，樣品量＞2 μg，樣品濃度＞50 ng?μL-1）送至北京諾禾致源科技（天津）股份有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建，采用Hiseq4000（Illumina，CA）進(jìn)行基因組重測序，測序深度為70×，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制及過濾后，獲得Clean Data。參考桃基因組，采用IGV軟件對生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找與親本表型一致的SNP位點(diǎn)。

1.5 抗蚜性狀緊密連鎖標(biāo)記的開發(fā)

基于兩親本（‘01-77-3’ב中油桃13號’）深度測序數(shù)據(jù)，在初步定位區(qū)間內(nèi)依據(jù)雙親的基因型和表型開發(fā)更多的SNP標(biāo)記，平均每200 Kb處設(shè)計(jì)1對引物，引物的退火溫度在60—63℃，引物長度20—25 bp，擴(kuò)增片段長度約為150 bp或700 bp。采用HRM（High Resolution Melting）和Sanger測序技術(shù)對雜交組合‘01-77-3’ב中油桃13號’后代群體單株進(jìn)行SNP基因分型，確立緊密連鎖的SNP標(biāo)記。HRM master mix試劑購自Roche，在LightCycler 480II定量PCR儀（Roche）上進(jìn)行SNP基因分型，HRM基因分型參考魯振華等[14]的方法。

1.6 基于分子標(biāo)記的植株表型鑒定

根據(jù)已經(jīng)獲得的緊密連鎖的SNP標(biāo)記的物理位置，參考桃基因組數(shù)據(jù)在親本（‘96-5-1’‘10-7’）中開發(fā)表型和基因型一致的InDel標(biāo)記KYYZ_Pp01_ 45799758。即在同一位點(diǎn)，抗蚜親本基因型為Rr，感蚜基因型為rr。隨機(jī)選取92個(gè)雜交F1代單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴(kuò)增片段進(jìn)行分離、檢測。目的是利用定位區(qū)間內(nèi)的分子標(biāo)記對雜交后代單株的表型進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 抗蚜表型鑒定

觀察蚜蟲對桃新梢的危害，確定抗蚜和感蚜的表型，其中呈紅點(diǎn)狀無其他危害癥狀的為抗蚜類型，具有明顯危害癥狀的為感蚜類型。對‘01-77-3’ב中油桃13號’雜交后代141株實(shí)生苗的表型評價(jià)表明，67株實(shí)生苗抗蚜特性明顯，無蚜蟲侵害，無卷葉，新梢蚜蟲刺探部位有明顯的紅色斑點(diǎn)，為抗蚜型；74株實(shí)生苗新稍葉背均有蚜蟲，出現(xiàn)不同程度的卷葉（2—4級），為感蚜型；二者比例接近1﹕1（值為0.556，χ2為0.348），符合孟德爾遺傳規(guī)律?！?6-5-1’ב10-7’雜交獲得F1后代116株實(shí)生苗，經(jīng)表型鑒定后隨機(jī)選取92個(gè)單株（抗蚜型33株，感蚜型59株），用于驗(yàn)證定位區(qū)間的準(zhǔn)確性。

2.2 基因的初步定位

基于Genome Database for Rosaceae數(shù)據(jù)庫的桃基因組（Peach v2.0）序列，依據(jù)雙親重測序數(shù)據(jù)，開發(fā)與抗蚜表型一致的SNP標(biāo)記，共設(shè)計(jì)引物108對，在親本及感蚜型、抗蚜型各4個(gè)子代中PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger測序。將測序結(jié)果在CExpress軟件中打開，序列對齊后根據(jù)親本與子代的基因型和表型尋找候選SNP標(biāo)記，篩選出基因型與表型一致的引物68對，初步獲得可能連鎖的標(biāo)記；通過擴(kuò)大雜交群體，在抗蚜型和感蚜型各20個(gè)后代單株中進(jìn)一步驗(yàn)證連鎖關(guān)系，進(jìn)而在全部樣品中驗(yàn)證。最終獲得了與抗蚜性狀連鎖的SNP標(biāo)記SNP_Pp01_38011783與SNP_Pp01_47231340，分別位于桃參考基因組（v2.0.a1）Pp01的38.02 Mb與47.23 Mb處，將目的基因初步定位至Pp01_38011783與Pp01_47231340之間，遺傳距離約為9.22 Mb。

2.3 親本深度測序數(shù)據(jù)分析

本次測序共產(chǎn)生Raw data均為17.956 Gb，過濾后的Clean data 17.109 Gb，測序質(zhì)量較高，其中Q20≥94.85%，Q30≥88.57%，全基因組GC含量為39.04%。參考基因組大小為227 411 381 bp，所有樣本的比對率為96.75%，對參考基因組（排除N區(qū)）的平均覆蓋深度為75.19×，1×覆蓋度（至少有一個(gè)堿基的覆蓋）在98.87%以上。

分析結(jié)果顯示，樣本測序質(zhì)量合格，GC分布正常，建庫和測序成功，可用于后續(xù)的變異檢測及相關(guān)分析。

2.4 基因的精細(xì)定位

根據(jù)深度測序數(shù)據(jù)，開發(fā)雜交群體親本‘01-77-3’ב中油桃13號’的SNP。在Pp01初定位區(qū)間9.22 Mb內(nèi)，依據(jù)桃參考基因組設(shè)計(jì)引物，避開Poly區(qū)域、重復(fù)序列和微衛(wèi)星區(qū)域，以便能夠順利完成測序并獲得更多的SNP信息，在141個(gè)后代單株中擴(kuò)增，抗蚜生長型為Rr，感蚜生長型為rr。29對引物（表1）中，26對引物存在多態(tài)的SNP位點(diǎn)，約占總引物數(shù)的89.66％，其中11對引物的基因型與表型一致（圖2）。

結(jié)合Sanger測序與HRM對141個(gè)單株進(jìn)行基因分型，獲得的重組單株如圖3。在抗蚜基因位點(diǎn)兩翼各篩選出1對引物SNP_Pp01_45665389與SNP_Pp01_ 46120950，與抗蚜基因緊密連鎖。分別位于桃參考基因組Pp01的45.66 Mb和46.12 Mb位置，在母本‘01-77-3’中引物SNP_Pp01_45665389的SNP位點(diǎn)為C/T，在父本‘中油桃13號’中SNP位點(diǎn)為T/T（圖4）；而在母本‘01-77-3’中引物SNP_Pp01_ 46120950的SNP位點(diǎn)為G/C，在父本‘中油桃13號’中SNP位點(diǎn)為C/C。

表1 基因定位引物序列

另外，在以上兩個(gè)緊密連鎖的標(biāo)記之間獲得一對引物SNP_Pp01_45712702，與抗蚜基因完全連鎖，位于桃基因組Pp01的45.71 Mb處，在母本‘01-77-3’中SNP位點(diǎn)為G/T，在父本‘中油桃13號’中SNP位點(diǎn)為G/G（圖5）。

2.5 基于分子標(biāo)記的植株表型鑒定

根據(jù)已經(jīng)獲得的緊密連鎖的SNP標(biāo)記的物理位置，在親本（‘96-5-1’‘10-7’）中開發(fā)表型和基因型一致的InDel標(biāo)記KYYZ_Pp01_45799758（表1），并在92個(gè)后代單株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后，抗蚜單株呈現(xiàn)明顯的兩條帶，分別為150 bp與200 bp，感蚜單株呈單條帶，為150 bp；且150 bp處不同表型對應(yīng)條帶具有明顯的多態(tài)性（圖6），證明該InDel可用于驗(yàn)證標(biāo)記與表型是否連鎖。通過標(biāo)記基因型和表型比較發(fā)現(xiàn)，在92個(gè)樣品中，僅1個(gè)樣品基因型與表型不一致，驗(yàn)證符合率為98.91%。

圖2 與目標(biāo)性狀的連鎖SNP標(biāo)記在LG01的位置

基于已將目的基因定位在Pp01_45665389—Pp01_46120950，物理距離約460 kb，介于Prupe. 1G559300與Prupe.1G564800兩基因之間，共包含56個(gè)轉(zhuǎn)錄本，52個(gè)候選基因，其中包括蟲漆酶14、β-D-木糖苷酶、γ-微管蛋白、Loricrin相關(guān)蛋白、DNA結(jié)合蛋白、P環(huán)核苷三磷酸水解酶蛋白超家族、磷酸吡哆醛（PLP）端依賴轉(zhuǎn)移酶蛋白超家族等（詳見基因注釋v2.0，https://www.rosaceae.org/search/genes）。

3 討論

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指單個(gè)核苷酸的變異導(dǎo)致的DNA序列多態(tài)性，且等位基因頻率不低于1%[15]。目前，SNP標(biāo)記已被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助選擇育種[16]和全基因組關(guān)聯(lián)分析[17-20]。VERDE等[21]通過對56個(gè)桃進(jìn)行測序，獲得了大量SNP位點(diǎn)，分布于桃的8對染色體，平均約每26.7 Kb一個(gè)SNP。本研究參考桃基因組數(shù)據(jù)，利用親本全基因組深度測序數(shù)據(jù)開發(fā)SNP標(biāo)記，多態(tài)率為40%。本研究基于初步定位的區(qū)間，利用雙親重測序數(shù)據(jù)有助于開發(fā)更多SNP標(biāo)記，解決了親本親緣關(guān)系較近時(shí)，難以獲得多態(tài)的SNP標(biāo)記的問題；且獲得的SNP標(biāo)記具有針對性，更準(zhǔn)確、有效，有利于高效、精確地定位抗蚜基因。

桃蚜是春季危害桃樹最常見的害蟲之一，4—5月為蚜蟲繁殖高峰期，其群集于新梢嫩葉背面危害，抑制新梢生長，危害幼果，導(dǎo)致果實(shí)畸形，品質(zhì)下降[22]。關(guān)于桃蚜的防治已有多種報(bào)道，化學(xué)農(nóng)藥的殘留會(huì)對環(huán)境產(chǎn)生威脅、蚜蟲的抗藥性等問題的出現(xiàn)，使得化學(xué)防治在桃園管理方面的作用逐漸減小，生物防治對桃蚜蟲的控制也具有很大的局限性[23-25]。因此，研究桃抗蚜遺傳機(jī)制，培育抗蚜新品種是防治蚜蟲的一種有效途徑。已有報(bào)道表明甜瓜、番茄、蘋果等多種植物中存在抗蚜基因[26-29]。Monet等[30]最早發(fā)現(xiàn)桃‘Weeping Flower Peach’具有抗蚜性狀，受顯性單基因控制，并將該抗蚜基因命名為。隨后法國農(nóng)業(yè)科學(xué)院（INRA）對抗蚜資源‘Rubira?’進(jìn)行抗性遺傳特征及基因定位研究，發(fā)現(xiàn)其受顯性單基因控制，并將抗性基因定位在pchgms29與UDAp-467兩標(biāo)記之間，位于LG1末端Pp01_ 43499521—Pp01_46502361區(qū)間內(nèi)，物理距離約3 Mb[12,31]。PASCAL等[32]研究發(fā)現(xiàn)來源于‘Weeping Flower Peach’的抗蚜基因也位于LG1末端，定位區(qū)間為物理距離2 880 352 bp（遺傳距離7.2 cM），并認(rèn)為與位于染色體的同一位點(diǎn)。本研究以來源于中國的重要抗性資源‘粉壽星’為材料，將抗蚜基因定位至Pp01，物理距離僅460 kb的區(qū)間內(nèi)（遺傳距離約3.5 cM），但來源于‘粉壽星’的抗蚜基因與與是否位于Pp01的同一位點(diǎn)二者是否存在不同的變異形式以及來源是否相同，還需進(jìn)一步研究。另外，雖然將精細(xì)定位區(qū)間縮小至460 Kb（包含52個(gè)候選基因），但控制抗蚜性狀的候選基因還不能確定，仍需進(jìn)一步研究。

GY表示感蚜，KY表示抗蚜；黃色表示基因型為Rr；綠色表示基因型為rr；紅色表示重組單株

圖4 基于HRM抗蚜C/T（藍(lán)色曲線）和感蚜T/T（紅色曲線）位點(diǎn)的SNP鑒定

A：抗蚜基因型G/T；B：感蚜基因型G/G A: Aphid resistant genotype-G/T; B: Aphid susceptibility genotype-G/G

M表示DNA標(biāo)記500；R表示抗蚜；S表示感蚜；♀：母本；♂：父本

抗蚜性狀鑒定具有多種途徑。其中，傳統(tǒng)的田間觀察是最直觀、簡便的方法，但由于抗蚜表型易受外界環(huán)境影響，且蚜蟲的發(fā)生具有季節(jié)性[22]，表型鑒定耗時(shí)長，且需對群體單株逐一調(diào)查，需投入大量人力物力[33]。分子標(biāo)記是一種有效的性狀鑒定方法，本研究基于精細(xì)定位區(qū)間，開發(fā)了與性狀連鎖的InDel標(biāo)記，缺失大小為2 bp，準(zhǔn)確、有效地完成了表型的分子鑒定。

4 結(jié)論

本研究基于親本全基因組深度測序與SNP分型相結(jié)合的方法，對目標(biāo)性狀進(jìn)行基因定位。通過基因定位初步將目標(biāo)性狀定位在桃基因組Pp01，物理區(qū)間約9.22 Mb。在初步定位區(qū)域內(nèi)利用重測序數(shù)據(jù)開發(fā)與抗蚜表型一致的SNP標(biāo)記，利用基于高分辨率熔解曲線（HRM）結(jié)合Sanger測序進(jìn)一步進(jìn)行精細(xì)定位，將目標(biāo)基因縮小至Pp01_45665389—Pp01_46120950區(qū)域內(nèi)，物理距離460 kb，包含56個(gè)轉(zhuǎn)錄本，52個(gè)候選基因。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Gene Mapping of Aphid-resistant for Peach Using SNP Markers

Zhang NanNan, Lu ZhenHua, Cui GuoChao, Pan Lei, Zeng WenFang, Niu Liang, Wang ZhiQiang

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Peach and Grape Improvement Center/ Key Laboratory of Fruit Breeding Technology of Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450009)

The objective of this study is to identify the SNP loci tightly linked to peach((L.) Batsch ) aphid((Sulzer)) resistance traits, revealing its genetic basis and laying a foundation for the marker assistant selection in resistance breeding of peach.In this study, the population used for the mapping study consisted of141 individuals which were obtained from a cross between female parent (‘01-77-3’ ) and male parent (‘CN13’). Referencing the peach genome and using Sanger sequencing, single nucleotide polymorphism (SNP) markers were developed in female and male parents and 8 progenies to obtain markers linked to the target loci which were tested on the whole population. Subsequently, using whole genome re-sequencing data of two parents, SNPs for fine mapping were selected based on the genotype of two parents, andemployed to conduct genotyping to obtain the SNP marker linked to resistance traits. Ultimately, the fine mapping region was validated by using an InDel marker to verify the genotype of F1population generated from ‘96-5-1’ × ‘10-7’.As a result of phenotypeidentification of 141 progenies, the segregation ratio of resistance to aphid to susceptible ones showed 1﹕1 (: 0.556; χ2: 0.348). Using Sanger sequencing we mapped the resistant gene to an approximate 9.92 Mb physical distance between two SNP markers, Pp01_38011783 and Pp01_47231340 on Pp01. For fine mapping, a total of 17.109 Gb clean data was generated from genome re-sequencing and the average coverage depth is 75.19×. 11 of 29 pairs of primers which were designed based on genome re-sequencing data were effective and linked to target trait. As a result of genotyping, we obtained two SNP makers tightly linked to desired trait, SNP_Pp01_45665389 and SNP_Pp01_46120950, with genetic distance of 1.4 cM and 2.1 cM, respectively. The target locus was between these two markers, an approximate physical distance of 460 Kb, and the gene was co-segregating with another marker SNP_Pp01_45712702. With fine gene mapping region, an InDel marker, KYYZ_Pp01_45799758, was designed and used to verify the phenotype of 92 individuals generated from an F1segregation population of ‘96-5-1’ ב10-7’ with 98.91% accuracy.The SNP loci and candidate genes related closely with aphid-resistant gene of peach were identified in this study. The resistant gene had been mapped to an approximate 460 kb physical distance between two SNP markers, SNP_Pp01_45665389 and SNP_Pp01_46120950 at the bottom of Pp01 which contains 56 transcripts (52 candidate genes).

; SNP markers; aphid-resistant; gene mapping

2017-06-02；

2017-09-07

國家自然科學(xué)基金（31470679）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2016-ZFRI）、河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（152102110110）

聯(lián)系方式：張南南，Tel：18638212579；E-mail：18763895031@163.com。通信作者牛良，Tel：13786834196，E-mail：niuliang@caas.cn；通信作者王志強(qiáng)，Tel：13703841063，E-mail：wangzhiqiang@caas.cn