太白山土壤放線菌分離方法及生態(tài)分布規(guī)律

王 鶴，彭 楚，來航線，韋小敏，姜影影

（西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌712100）

太白山土壤放線菌分離方法及生態(tài)分布規(guī)律

王 鶴，彭 楚，來航線，韋小敏，姜影影

（西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌712100）

研究了改良高氏培養(yǎng)基、甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、改良高氏二號培養(yǎng)基、海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基對太白山不同植被土壤放線菌的分離效果，并分析放線菌的生態(tài)分布規(guī)律。結(jié)果表明：太白山南北坡土壤養(yǎng)分大體呈現(xiàn)為中海拔林地含量相對較高，有機(jī)質(zhì)和全氮含量最高分別為77.81 g·kg－1和5.35 g·kg－1，低海拔林地與高海拔林地含量相對較低，有機(jī)質(zhì)和全氮含量最低分別為11.77 g·kg－1和0.85 g·kg－1，即自低海拔至高海拔不同林地類型土壤養(yǎng)分整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量與種類均高于其它培養(yǎng)基，其數(shù)量最高可達(dá)258×104cfu·g－1土，種類最多為35種；改良高氏培養(yǎng)基分離南坡的效果優(yōu)于北坡；R2A培養(yǎng)基分離中高海拔林地土壤優(yōu)勢更明顯。中海拔林地類型，如北坡的紅皮樺、牛皮樺，南坡的牛皮樺，分離的放線菌數(shù)量均顯著高于其它林地類型；土壤速效磷和全氮含量對放線菌的分離效果影響較大。

土壤養(yǎng)分；放線菌；分離方法；生態(tài)分布；太白山

放線菌是微生物中與人類關(guān)系非常密切且有實(shí)用價(jià)值的一類菌，以其較強(qiáng)的次級代謝產(chǎn)物能力而為人們所熟知，可作為抗生素、維生素、酶和酶抑制劑的產(chǎn)生菌，是一類具有實(shí)際價(jià)值的微生物資源。迄今為止，微生物產(chǎn)生的2萬多種生物活性物質(zhì)中有超過一半都是由放線菌產(chǎn)生的，而且目前廣泛應(yīng)用的抗生素約70%也是由放線菌產(chǎn)生。這些抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用不僅對人類健康起著不可替代的作用，還給人們帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益［1］。目前，關(guān)于放線菌資源的研究主要集中在現(xiàn)有物種中新活性物質(zhì)的開發(fā)以及新物種的分離兩個(gè)方面。

秦嶺是我國自然地理和氣候的南北分界線。太白山是秦嶺主峰，最高海拔3 767m［2］。太白山以其巨大的高山落差，形成了獨(dú)有的垂直氣候帶，自下而上分布著暖溫帶、溫帶、高山寒溫帶、高山亞寒帶及高山寒帶5個(gè)明顯的氣候帶［3］。其植被類型及土壤類型差異明顯，水熱條件迥異，是理想的放線菌分離源。但目前對放線菌的研究主要集中在北坡，對南坡以及南北坡綜合比較研究較少。

本研究選用太白山南北坡不同海拔高度的13個(gè)典型植被土壤為研究材料，通過設(shè)計(jì)不同養(yǎng)分的培養(yǎng)基質(zhì)研究不同林地類型土壤放線菌分離效果，得到適合不同林地及不同坡向的培養(yǎng)基；并分析太白山不同林地放線菌生態(tài)分布規(guī)律，旨在為后續(xù)不同林地類型放線菌分離培養(yǎng)基質(zhì)選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤樣品 13種供試土樣采自秦嶺主峰太白山（33°52′88″～34°04′22″N，107°41′86″～107°49′00″E）。選取5個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣，去除表面的枯枝落葉層及腐殖層，采集其下的土層，充分混合后四分法取土，裝入無菌塑封袋中。將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，土樣自然風(fēng)干20 d，研磨過1 mm篩，裝入塑封袋中備用。供試土壤樣品采集點(diǎn)的環(huán)境條件見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）改良高氏培養(yǎng)基［4］（G）：可溶性淀粉 15.0 g，腐殖酸 0.5 g，硝酸鉀 1 g，磷酸氫二鉀 0.5 g，硫酸鎂 0.5 g，七水合硫酸亞鐵 0.02 g，維生素族 0.5 mg，瓊脂 15 g，pH 7.2～7.4，自來水 1 000 mL。（維生素族：維生素B1、核黃素、煙酸、維生素B6、泛酸鈣、肌醇、P－氨基苯甲酸各0.5mg，生物素0.25mg，下同）

（2）甘油 －天門冬酰胺培養(yǎng)基［5］（L）：L－天門冬酰胺1 g，甘油10 g，磷酸氫二鉀0.5 g，微鹽溶液1 mL，瓊脂 15 g，pH 7.2，自來水 1 000mL。

（3）R2A培養(yǎng)基［6］（R）：酵母粉 0.5 g，胰蛋白胨0.25 g，蛋白胨 0.75 g，葡萄糖 0.5 g，淀粉 0.5 g，磷酸氫二鉀 0.3 g，硫酸鎂 0.024 g，丙酮酸鈉 0.3 g，瓊脂 15 g，pH 7.2，自來水 1 000mL。

（4）改良高氏二號培養(yǎng)基［7］（E）：葡萄糖 1 g，蛋白胨 0.5 g，胰胨 0.3 g，氯化鈉 0.5 g，復(fù)合維生素0.5 mg，瓊脂 15 g，pH 7.2，自來水 1 000 mL。

（5）海藻糖 －脯氨酸培養(yǎng)基［7］（D）：海藻糖 5 g，脯氨酸 1 g，硫酸銨 1 g，氯化鈉 1 g，氯化鈣 2 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂1 g，復(fù)合維生素0.5 mg，瓊脂15 g，pH 7.2，自來水 1 000mL。

純化培養(yǎng)基統(tǒng)一采用改良高氏培養(yǎng)基。

1.1.3 抑制劑 5種分離培養(yǎng)基抑制劑均選用重鉻酸鉀，濃度為 80μg·mL－1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤養(yǎng)分含量的測定 土壤養(yǎng)分測定參照

《土壤農(nóng)化分析》［8］，其中 pH采用 pH計(jì)測量，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱氧化法測定，全氮采用凱氏定氮法測定，速效氮采用流動分析儀法測定，速效磷采用NaHCO3浸提－鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用NH4OAc浸提，火焰光度計(jì)法測定。

1.2.2 放線菌的分離及培養(yǎng) 采用稀釋平板涂布法進(jìn)行分離［9］。分別稱取5.0 g供試土樣加入裝有45mL無菌水的三角瓶中，180 r·min－1震蕩 30 min進(jìn)行10－1稀釋，依次吸取 1.0 mL加入 9.0 mL無菌水中做 10－2、10－3稀釋。分別吸取 0.1 mL 10－2、10－3兩個(gè)稀釋度的樣品懸液涂布于5種分離培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)15 d，將培養(yǎng)皿中形態(tài)明顯不同的菌落視為不同種類，對其數(shù)量及種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；將菌株接入改良高氏斜面，28℃培養(yǎng)7 d保存。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林地類型土壤養(yǎng)分特征

土壤養(yǎng)分含量對微生物的構(gòu)成意義重大。對13個(gè)土樣的部分養(yǎng)分含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 太白山不同植被土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Basic chemical properties of the soil samples on Taibaimountain

由表2知，太白山北坡供試土壤pH值為5.07～6.58，太白紅杉和牛皮樺顯著高于其它植物，銳齒櫟最低；有機(jī)質(zhì)含量介于 23.85～77.58 g·kg－1，巴山冷杉土壤的有機(jī)質(zhì)含量顯著高于其它植物，銳齒櫟土壤最低；全氮含量介于 0.85～2.81 g·kg－1，其中巴山冷杉土壤的全氮含量顯著高于其它植物，遼東櫟次之，銳齒櫟土壤最低；銨態(tài)氮含量介于2.13～9.63mg·kg－1，巴山冷杉、高山草甸、紅皮樺、太白紅杉、紅皮樺、遼東櫟、銳齒櫟差異顯著；硝態(tài)氮含量介于 3.42～10.15mg·kg－1，其中銳齒櫟土壤硝態(tài)氮含量顯著高于其它植物，遼東櫟次之，牛皮樺土壤最低；速效磷含量介于 2.69～4.05 mg·kg－1，其中遼東櫟和紅皮樺土壤顯著高于其它植物，銳齒櫟、太白紅杉、牛皮樺、高山草甸差異顯著；速效鉀含量介于50.42～242.31mg·kg－1，其中巴山冷杉土壤的速效磷含量顯著高于其它植物，牛皮樺次之，高山草甸和遼東櫟土壤最低。綜合各類指標(biāo)，巴山冷杉土壤肥力最高，銳齒櫟和高山草甸最低。

由表2還可知，太白山南坡供試土壤pH值介于5.68～6.41，紅皮樺、牛皮樺和高山灌叢顯著高于其它植物，高山草甸、太白紅杉和銳齒櫟含量最低；有機(jī)質(zhì)含量介于 11.77～77.81 g·kg－1，高山灌叢土壤的有機(jī)質(zhì)含量顯著高于其它植物，銳齒櫟土壤最低；全氮含量介于 0.89～5.35 g·kg－1，巴山冷杉土壤的全氮含量顯著高于其它植物，紅皮樺和牛皮樺基本持平，太白紅杉、銳齒櫟、高山草甸、高山灌叢差異顯著；銨態(tài)氮含量介于 2.20～11.93 mg·kg－1，紅皮樺、牛皮樺、巴山冷杉、高山草甸、高山灌叢、太白紅杉、銳齒櫟差異顯著；硝態(tài)氮含量介于 3.49～12.06mg·kg－1，太白紅杉、巴山冷杉、高山灌叢、紅皮樺、牛皮樺、高山草甸、銳齒櫟差異顯著；速效磷含量介于 2.69～7.15 mg·kg－1，其中紅皮樺土壤顯著高于其它植物，高山草甸土壤最低；速效鉀含量介于63.65～202.38 mg·kg－1，太白紅杉、紅皮樺、高山灌叢、牛皮樺、銳齒櫟、巴山冷杉、高山草甸差異顯著。綜合各類指標(biāo)，太白紅杉和牛皮樺肥力較高，銳齒櫟和高山草甸最低。

綜合比較南北坡養(yǎng)分含量可知，南坡pH值為5.68～6.41，北坡 pH含量為 5.07～6.58，北坡變幅比南坡大，北坡最低pH為5.07；有機(jī)質(zhì)含量差異較大，最大為 77.81 g·kg－1，最小為 11.77 g·kg－1；南坡供試土壤全氮含量最高為 5.35 g·kg－1，北坡僅為2.81 g·kg－1，南坡土壤全氮含量高于北坡；硝銨態(tài)氮含量南北坡差異不大；速效磷含量南坡最高值為7.15mg·kg－1，北坡最高值為 4.05 mg·kg－1，南坡土壤速效磷含量高于北坡；速效鉀含量南北坡基本持平。整體而言，太白山南北坡土壤養(yǎng)分大體呈現(xiàn)中海拔林地含量相對較高，如巴山冷杉，低海拔林地與高海拔林地含量相對較低，如銳齒櫟和高山草甸，即自低海拔至高海拔不同林地類型土壤養(yǎng)分整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。且南坡的土壤養(yǎng)分含量較北坡高，這可能是由于南坡光照充足，溫度較高，水熱條件更有利于微生物活動，因而促進(jìn)了養(yǎng)分積累。

2.2 不同培養(yǎng)基放線菌分離效果

培養(yǎng)基直接為放線菌提供生長繁殖所必需的各種碳源、氮源、無機(jī)鹽及生長因子等，不同放線菌種類對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。采用5種培養(yǎng)基對太白山南北坡海拔高度不同的13種典型林地土壤中的放線菌進(jìn)行了分離，分離效果見表3，表4。

表3 5種培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量／（104 cfu·g－1）Table 3 Isolated soil actinomycete quantity in five kinds of culturemedium

2.2.1 放線菌數(shù)量 由表3分析北坡放線菌數(shù)量可知，甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離銳齒櫟、遼東櫟、紅皮樺和高山草甸土壤中放線菌的效果明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，數(shù)量最高可達(dá)258×104cfu·g－1土，分離牛皮樺與R2A培養(yǎng)基（R）相當(dāng)，而分離巴山冷杉、太白紅杉土壤中放線菌效果略低于R2A（R）；R2A培養(yǎng)基（R）除在分離銳齒櫟和遼東櫟效果低于其它培養(yǎng)基，在其它土壤類型放線菌的分離效果都優(yōu)于或與其它培養(yǎng)基持平；改良高氏（G）和改良高氏二號（E）分離效果表現(xiàn)一般；海藻糖－脯氨酸（D）分離效果不佳，僅為 2.0～7.0×104cfu·g－1土，但該培養(yǎng)基主要用于分離稀有放線菌，數(shù)量不占優(yōu)屬正常。5種培養(yǎng)基中，甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離放線菌數(shù)效果最好，R2A培養(yǎng)基（R）次之，海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基（D）最差。

由表3分析南坡可知，改良高氏培養(yǎng)基（G）分離紅皮樺土壤放線菌的數(shù)量與改良高氏二號培養(yǎng)基（E）相近，并顯著高于其它培養(yǎng)基，在分離高山草甸土壤放線菌時(shí)甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）效果最好，并顯著高于其它培養(yǎng)基；甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離高山草甸土壤效果最好；R2A培養(yǎng)基（R）分離太白紅杉土壤中放線菌的效果明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基；海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基（D）分離時(shí)污染嚴(yán)重，故未作分析。5種培養(yǎng)基中，改良高氏（G）和甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離放線菌數(shù)效果最好，R2A培養(yǎng)基（R）較好。

綜合分析南北坡分離的放線菌數(shù)量可知，甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離放線菌效果最好，數(shù)量最高可達(dá) 258×104cfu·g－1土；R2A培養(yǎng)基（R）次之，該培養(yǎng)基在中海拔以上的分離效果優(yōu)勢更明顯；改良高氏培養(yǎng)基（G）在南坡分離放線菌的數(shù)量明顯高于北坡；改良高氏二號培養(yǎng)基（E）整體表現(xiàn)一般。不同培養(yǎng)基分離放線菌數(shù)量差別可能與培養(yǎng)基本身養(yǎng)分構(gòu)成有關(guān)，同時(shí)受海拔高度、光照及溫度、植被類型、土壤養(yǎng)分等影響。

表4 5種培養(yǎng)基分離的放線菌種類數(shù)Table 4 Numbers of isolated soil actinomycetetypes on five kinds of culturemedium

2.2.2 放線菌種類 由表4分析北坡可知，甘油－天門冬酰胺（L）培養(yǎng)基分離銳齒櫟、遼東櫟和高山草甸土壤放線菌的效果明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，分離紅皮樺、牛皮樺、巴山冷杉土壤放線菌的效果與R2A（R）培養(yǎng)基相當(dāng)，為35種；R2A培養(yǎng)基（R）除分離銳齒櫟土壤放線菌效果劣于其它培養(yǎng)基外，對其它類型土壤放線菌的分離效果優(yōu)于或等于其它培養(yǎng)基；改良高氏（G）和改良高氏二號（E）培養(yǎng)基分離效果不明顯；海藻糖－脯氨酸（D）培養(yǎng)基分離放線菌種類較少，但該培養(yǎng)基主要用于分離稀有放線菌，分離種類數(shù)上不占優(yōu)屬正常，且其得到的放線菌形態(tài)觀察較特別。5種培養(yǎng)基中，甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離放線菌種類最多，R2A培養(yǎng)基（R）次之。

首先，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)有生豬發(fā)病，則應(yīng)當(dāng)立即將病豬與其他豬群進(jìn)行隔離，并針對豬舍進(jìn)行嚴(yán)格、徹底的清理，消除疾病對其他生豬所產(chǎn)生的潛在威脅。倘若發(fā)現(xiàn)該疾病存在擴(kuò)散、感染的趨勢，則應(yīng)當(dāng)將產(chǎn)生類似癥狀的病豬進(jìn)行嚴(yán)格隔離，并針對飼養(yǎng)環(huán)境、豬舍進(jìn)行徹底的清潔與消毒，還要針對運(yùn)輸工具、飼養(yǎng)用具以及飼養(yǎng)服等進(jìn)行全面消毒。此外，針對發(fā)病死亡的尸體、病豬排泄物以及飼養(yǎng)過程中產(chǎn)生的其他廢棄物也要依照衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行無害化處理，避免疫病的再次傳播與蔓延。

由表4，分析南坡放線菌種類可知，甘油－天門冬酰胺（L）培養(yǎng)基分離高山灌叢和高山草甸土壤中放線菌的效果明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，分離銳齒櫟、巴山冷杉、太白紅杉土壤放線菌的效果與R2A（R）培養(yǎng)基相當(dāng)；R2A（R）和改良高氏（G）培養(yǎng)基的分離效果基本一致，改良高氏二號（E）培養(yǎng)基的分離效果不佳，海藻糖－脯氨酸（D）分離過程霉菌污染嚴(yán)重，故未作分析。5種培養(yǎng)基中，甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離放線菌種類最多，R2A（R）和改良高氏（G）培養(yǎng)基次之。

綜合分析南北坡分離的放線菌種類可知，甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）分離放線菌種類最多，為35種；R2A（R）和改良高氏（G）培養(yǎng)基分離效果相當(dāng)，低于甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L）；海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基（D）分離放線菌種類數(shù)最少，僅為4種，但初步形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果顯示其種類較為獨(dú)特，可見其分離稀有放線菌確有優(yōu)勢。不同培養(yǎng)基分離放線菌種類差別可能主要與培養(yǎng)基養(yǎng)分構(gòu)成、植被類型等相關(guān)。

2.3 不同林地類型放線菌的分離效果及分布規(guī)律

圖1 太白山不同植被土壤分離放線菌數(shù)量Fig.1 Actinomycete quantity of the soil samples on Taibaimountain

圖2 太白山不同植被土壤分離放線菌種類Fig.2 Numbers of actinomycete types of the soil samples on Taibaimountain

土壤是放線菌生長的天然場所，不同植被類型的土壤中蘊(yùn)藏的放線菌資源存在一定差異。選取代表性最好的甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基對太白山南北坡海拔高度不同的13種典型林地土壤中放線菌的分布規(guī)律進(jìn)行了分析，結(jié)果見表3，表4，圖1，圖2。2.3.1 不同林地類型分離放線菌的數(shù)量及分布規(guī)律 分析北坡不同植被分離的放線菌數(shù)量可知，紅皮樺分離的放線菌數(shù)量為 258.0×104cfu·g－1土，明顯高于其它林地類型；牛皮樺、遼東櫟和銳齒櫟土壤分離放線菌數(shù)量差異較小，但均顯著低于紅皮樺；巴山冷杉、太白紅杉和高山草甸土壤分離放線菌數(shù)量相較于前四種土壤類型，顯著降低。

分析南坡不同植被分離的放線菌數(shù)量可知，牛皮樺分離的放線菌數(shù)量為 225.0×104cfu·g－1土，明顯高于其它林地類型；銳齒櫟較紅皮樺低，但顯著高于其它植被；巴山冷杉和紅皮樺之間分離數(shù)量差別不大，均低于牛皮樺和銳齒櫟；太白紅杉、高山灌叢、高山草甸分離的放線菌數(shù)量依次呈現(xiàn)顯著差異。

由圖1可知，銳齒櫟和紅皮樺放線菌的分離數(shù)量北坡高于南坡，牛皮樺、巴山冷杉和太白紅杉分離放線菌數(shù)量北坡低于南坡，可見隨著海拔的升高，南坡土壤放線菌數(shù)量逐漸增加。南北坡不同植被分離放線菌的數(shù)量，均隨著海拔升高，先升高后降低，這與土壤養(yǎng)分的變化趨勢是一致的。這可能是由于海拔升高，光照充足，溫度升高，有利于微生物的活動。

2.3.2 不同林地類型分離放線菌的種類及分布規(guī)律 分析北坡不同林地類型分離的放線菌種類可知，遼東櫟和銳齒櫟分離放線菌種類數(shù)高于或顯著高于其它林地類型，分離的種類數(shù)分別為35種和30種；太白紅杉較二者低，但顯著高于其它林地類型；牛皮樺和紅皮樺分離的放線菌種類數(shù)無差異；太白紅杉中分離的放線菌種類最少，為13種。

由圖2可知，銳齒櫟、牛皮樺和太白紅杉的分離種類數(shù)北坡高于南坡，紅皮樺分離的種類數(shù)南北坡大致相當(dāng)，巴山冷杉的分離種類數(shù)北坡低于南坡。南北坡不同林地類型分離放線菌的種類數(shù)均表現(xiàn)出隨著海拔升高先降低后升高又降低的趨勢。

2.4 放線菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性

土壤微生物數(shù)量與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān)［10－11］。分析五種培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分的相關(guān)性，結(jié)果見表5，表6。

由表5，分析各養(yǎng)分之間關(guān)系可知，pH和有機(jī)質(zhì)、全氮、硝銨態(tài)氮和速效鉀之間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮的相關(guān)性達(dá)顯著水平，與速效磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。有機(jī)質(zhì)與全氮和速效鉀呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，同銨態(tài)氮呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮和速效磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。銨態(tài)氮和速效磷呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與速效鉀呈顯著正相關(guān)關(guān)系。硝態(tài)氮與速效磷、速效鉀均呈正相關(guān)關(guān)系。速效磷與速效鉀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。分析養(yǎng)分與各培養(yǎng)基之間關(guān)系可知，改良高氏（G）、甘油 －天門冬酰胺（L）和改良高氏二號（E）培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量與速效磷含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而與pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、銨態(tài)氮、速效鉀均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。R2A培養(yǎng)基與速效磷呈正相關(guān)關(guān)系。海藻糖－脯氨酸（D）培養(yǎng)基與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

由表6分析各養(yǎng)分之間關(guān)系可知，pH和有機(jī)質(zhì)、全氮、硝銨態(tài)氮、速效磷、速效鉀之間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，與銨態(tài)氮相關(guān)性極顯著。有機(jī)質(zhì)與全氮、硝銨態(tài)氮、速效鉀均呈正相關(guān)關(guān)系，與速效磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。全氮與硝銨態(tài)氮、速效磷呈正相關(guān)關(guān)系，與銨態(tài)氮相關(guān)性顯著，與速效鉀呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。硝銨態(tài)氮與速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系。速效磷與速效鉀呈正相關(guān)關(guān)系。分析養(yǎng)分與各培養(yǎng)基之間關(guān)系可知，改良高氏（G）、甘油 －天門冬酰胺（L）、R2A（R）和改良高氏二號（E）培養(yǎng)基分離的放線菌數(shù)量與全氮、銨態(tài)氮呈正相關(guān)關(guān)系，與pH、速效磷、速效鉀呈正相關(guān)性，而與有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。海藻糖－脯氨酸（D）與各養(yǎng)分之間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

綜合分析可知，改良高氏（G）、甘油－天門冬酰胺（L）、R2A（R）和改良高氏二號（E）培養(yǎng)基分離放線菌數(shù)量與速效磷相關(guān)性較好，且南北坡均表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系；與有機(jī)質(zhì)相關(guān)性南北坡均表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系；與全氮、銨態(tài)氮相關(guān)性較好，與pH、速效鉀相關(guān)性一般，且相關(guān)關(guān)系均表現(xiàn)出北坡負(fù)相關(guān)，南坡正相關(guān)。海藻糖－脯氨酸（D）與各養(yǎng)分相關(guān)關(guān)系均不顯著。

表5 北坡分離放線菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分指標(biāo)相關(guān)關(guān)系Table 5 Relationship between actinomycete quantity and soil nutrients on the north slope

表6 南坡分離放線菌數(shù)量與土壤養(yǎng)分指標(biāo)相關(guān)關(guān)系Table 6 Relationship between actinomycete quantity and soil nutrients on the south slope

3 討論與結(jié)論

呂世麗［12］等研究表明秦嶺牛背梁自然保護(hù)區(qū)不同海拔土壤養(yǎng)分狀況存在差異，各養(yǎng)分含量的最大值多出現(xiàn)在海拔1 900～2 000m，各養(yǎng)分含量隨海拔高度的變異規(guī)律存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，秦嶺主峰太白山南北坡土壤養(yǎng)分大體呈現(xiàn)中海拔林地含量相對較高，低海拔林地與高海拔林地含量相對較低，即自低海拔至高海拔不同林地類型土壤養(yǎng)分整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與土壤中分離的放線菌數(shù)量的規(guī)律相一致。

有研究表明，高氏一號非常適合放線菌尤其是鏈霉菌的生長，腐殖酸、酵母膏作為碳源能分離多個(gè)屬的放線菌，海藻糖作為碳源有利于分離稀有放線菌［13－16］，在太白山不同海拔高度土壤中生存著大量拮抗性放線菌［17］。本研究所用五種培養(yǎng)基中，分離放線菌效果最好的是甘油－天門冬酰胺培養(yǎng)基（L），該培養(yǎng)基在分離數(shù)量及種類上均占優(yōu)，數(shù)量最高可達(dá)258×104cfu·g－1土，分離種類最多為35種；改良高氏培養(yǎng)基（G）在南坡的分離效果整體優(yōu)于北坡，更適用于分離南坡林地土壤的放線菌；R2A培養(yǎng)基（R）更適合分離中高海拔林地放線菌；海藻糖－脯氨酸培養(yǎng)基（D）在分離放線菌數(shù)量及種類都較少，但其分離得到的放線菌形態(tài)奇特，具體需進(jìn)行后續(xù)分子生物學(xué)鑒定分析。南北坡不同林地類型分離放線菌效果均表現(xiàn)出隨著海拔升高先升高后降低的趨勢。中海拔林地類型，如北坡的紅皮樺、牛皮樺，南坡的牛皮樺，分離的放線菌數(shù)量均顯著高于其它林地類型，最高海拔的高山草甸分離的放線菌數(shù)量最少。

放線菌數(shù)量及種類與土壤養(yǎng)分相關(guān)性不同。有研究表明土壤放線菌數(shù)量與有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量呈極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系［18－20］，也有研究表明放線菌含量與有機(jī)質(zhì)、全氮呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，分離放線菌數(shù)量與速效磷相關(guān)性較好，且南北坡均表現(xiàn)出較好的正相關(guān)關(guān)系；坡向?qū)Ψ啪€菌的分離效果與土壤養(yǎng)分的關(guān)系密切，放線菌分離效果與全氮、銨態(tài)氮相關(guān)性較好，pH、速效鉀相關(guān)性一般，且相關(guān)關(guān)系均表現(xiàn)出北坡負(fù)相關(guān)，南坡正相關(guān)。其原因可能是光照，溫度，降雨綜合影響土壤養(yǎng)分含量，導(dǎo)致局部環(huán)境差異較大，進(jìn)而導(dǎo)致土壤養(yǎng)分與分離效果相關(guān)關(guān)系在南北坡呈現(xiàn)較大差異。

［1］ Demian A L，Sanchez S.Microbial drug discovery：80 yeasof progress［J］.The Journal of Antibiotics，2009，62（1）：5-16.

［2］ 傅志軍，張行勇，劉順義，等.秦嶺植物區(qū)系和植被研究概述［J］.西北植物學(xué)報(bào)，1996，16：93-106.

［3］ 方 正，高淑貞.秦嶺太白山南北坡的植被垂直帶譜［J］.植物生態(tài)學(xué)與地植物學(xué)叢刊，1963，（1）：162-163.

［4］ 姜成林，徐麗華.微生物資源學(xué)（第二版）［M］.北京：科學(xué)出版社，1997：16-21.

［5］ 李文均，唐蜀昆，王 棟，等.新疆青海中度嗜鹽放線菌生物多樣性初步研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2004，44（1）：1-7.

［6］ 顧孔珍，錢 純，羅岳平.用R2A培養(yǎng)基提高飲用水中細(xì)菌總數(shù)檢出率［J］.凈水技術(shù)，2004，23（1）：42-44.

［7］ 彭云霞，姜 怡，段淑蓉，等.稀有放線菌的選擇性分離方法［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，29（1）：86-89.

［8］ 鮑士旦.土壤農(nóng)化分析（第三版）［M］.中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

［9］ 程麗娟，薛泉宏，來航線，等.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：世界圖書出版公司，1998.

［10］ Rao A V，Venkateswarlu B.Microbial ecology of the soils of Indian desert［J］.Agriculture Ecosystems＆Environment，1983，10（4）：361-369.

［11］ Venkateswarlu B，Rao A V.Distribution ofmicroorganisms in stabilised and unstabilised sand dunes of the Indian desert［J］.Journal of Arid Environments，1981，4（3）：203-207.

［12］ 呂世麗，李新平，李文斌，等.牛背梁自然保護(hù)區(qū)不同海拔高度森林土壤養(yǎng)分特征分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，41（4）：161-168.

［13］ 張學(xué)武，張建麗.稀有放線菌的選擇性分離［J］.生命科學(xué)儀器，2005，3（6）：17-20.

［14］ Bromfield E SP，Wheatcroft R，Barran L R.Medium for direct isolation of Rhizobium meliloti from soils［J］.Soil Biology and Biochemistry，1994，26（4）：423-428.

［15］ Hayakawa M，Nonomura H.Humic acid-vitamin agar，a newmedium for the selective isolation of soilactinomycetes［J］.Journalof Fermentation Technology，1987，65（5）：501-509.

［16］ 姜 怡，段淑蓉，唐蜀昆，等.稀有放線菌分離方法［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，1（1）：181-183.

［17］ 朱文杰，薛泉宏，曹艷茹，等.秦嶺太白山北坡土壤拮抗性放線菌分布及特性［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，22（11）：3003-3010.

［18］ 陳莉莉，王得祥，于 飛，等.松櫟混交林土壤微生物數(shù)量與土壤酶活性及土壤養(yǎng)分關(guān)系的研究［J］.土壤通報(bào)，2014，（1）：77-84.

［19］ 肖 燁，黃志剛，武海濤，等.三江平原典型濕地類型土壤微生物特征與土壤養(yǎng)分的研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2015，（5）：1842-1848.

［20］ 趙卉琳，來航線，馮昌增，等.新疆部分地區(qū)鹽堿荒漠化土壤養(yǎng)分及放線菌區(qū)系組成［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（1）：161-166.

［21］ 何志祥，朱 凡.雪峰山不同海拔梯度土壤養(yǎng)分和微生物空間分布研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（31）：73-78.

Study on method of actinomycetes isolation from soils of Taibai mountain and its ecological distribution

WANG He，PENG Chu，LAIHang-xian，WEIXiao-min，JIANG Ying-ying
（College of Nɑturɑl Resourcesɑnd Environment，Northwest A＆F University，Yɑngling，Shɑɑnxi 712100，Chinɑ）

The study explored themethod of actinomycetes isolation from soils of Taibaimountain through fivemedias，includingmodification No.1media、glycerin－asparaginemedia、R2Amedia、modification No.2mediaand trehalose－prolinemedia，and analyse its ecological distribution.The result showed that，soil nutrientof Taibaimountain on both north and south slope presented a relatively high concentration inmid-elevation forest type，themaximum concentration of organicmatter and total nitrogen was77.81 g·kg－1and 5.35 g·kg－1，respectively，a relatively low concentration in the both sites ofaltitude，organicmatter and totalnitrogen concentration were lowestat11.77 g·kg－1and 0.85 g·kg－1，respectively，whichmeans from low to high elevation in different forest types soilnutrientpresented a trend of reducing then rising as awhole；Analysis of actinomycetes number and variety on different soils of plant types showed thatmodification glycerin-asparaginemedia was apparently higher than that from others，with the quantity of 258×104cfu·g－1soil，35 species kinds，Modification No.1media showed a better separation effect on the south slope，whichmeanmore suitable for the separation of the south slope of different forestsoil actinomyces.There are obvious advantages of R2Amediawhile isolatingmid-elevation forest type.Mid-elevation forest type，such as red birch、betula utilise in north slope，betula utilise in south slope，represented a significant difference than other types on the number of isolated actinomycetes.Soil available phosphorus and total nitrogen concentration had a greater influence on the number and variety isolated from soils，slope affected the correlation between isolation result and soil nutrients.

soil nutrient；actinomycetes；isolationmethod；ecological distribution；Taibaimountain

S154.3

A

1000-7601（2017）05-0107-08

10.7606／j.issn.1000-7601.2017.05.16

2016-06-16

2016-10-27

王 鶴（1989—），女，吉林扶余人，碩士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail：821022301＠qq.com。

來航線（1964—），男，陜西禮泉人，副教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源與利用研究。E-mail：laikangxian＠163.com。