黃鱔醛酮還原酶基因的重組表達及多抗制備

王全禾, 江 翱, 楊 震, 李 偉

( 1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025; 2.武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072 )

黃鱔醛酮還原酶基因的重組表達及多抗制備

王全禾1, 江 翱2, 楊 震1, 李 偉1

( 1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025; 2.武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072 )

為實現(xiàn)原核表達黃鱔醛酮還原酶基因并制備其多克隆抗體，筆者利用基因特異性引物自黃鱔肝臟cDNA中擴增黃鱔醛酮還原酶全長序列，將之克隆至原核表達載體pET-28a(+)中，構(gòu)建了重組表達載體；經(jīng)測序驗證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后進行IPTG誘導(dǎo)。利用Ni離子親和柱純化了重組蛋白，通過多次免疫新西蘭兔制備了多克隆抗體；采用Western blot和免疫組化法鑒定兔抗醛酮還原酶多克隆抗體的特異性，用間接ELISA技術(shù)檢測多抗的效價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)成功構(gòu)建pET/ Eakr原核表達載體，并實現(xiàn)了重組蛋白的融合表達和純化；Western blot檢測表明制備的兔多克隆抗體不僅能特異性地識別來源于黃鱔4種組織的醛酮還原酶蛋白而且還可識別來源于黃顙魚、團頭魴、烏鱧、鯽魚和草魚的同源蛋白。免疫組化結(jié)果提示該多抗可特異性識別黃鱔小腸、肝胰組織和脾臟的醛酮還原酶蛋白。制備的多抗效價達1∶6400。

黃鱔;醛酮還原酶;重組表達;多克隆抗體

黃鱔(Monopterusalbus)又稱鱔魚、無鱗公子等，為合鰓目、合鰓科、黃鱔屬的唯一種。黃鱔屬底棲型魚類，通常在富含有機質(zhì)的水草及水流較緩的溪流中鉆洞穴居。由于肉質(zhì)鮮美，含有豐富的氨基酸和維生素，又具有較高的藥用和食用價值，黃鱔現(xiàn)已成為我國及亞洲許多國家淡水養(yǎng)殖中重要的養(yǎng)殖品種。醛酮還原酶(AKR)是一類依賴于NAD(P)H的分子量為34～37 ku的單體還原酶蛋白，在生物界廣泛分布[1]。醛酮還原酶超家族成員眾多，包含醛糖還原酶、醛還原酶、羥化類固醇脫氫酶、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶、多元醇脫氫酶、二氫二醇脫氫酶等多種能夠代謝機體羰基化合物的酶類[2]。該超家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)存在許多共性，如都包含一個(α/β)8的桶裝結(jié)構(gòu)、相似的輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個高度保守的Asp, Tyr, Lys, His催化四分體[3-4]。從功能上看，它們在生物體應(yīng)對外源性或內(nèi)源性羰基化合物的解毒過程中具有重要作用[5-7]，許多成員還參與了某些疾病的發(fā)生過程[8]。研究表明，醛酮還原酶超家族與癌癥侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性等問題的發(fā)生密切相關(guān)[9-10]，在機體抗衰老[11]、生物體內(nèi)氧化應(yīng)激[2]、致癌化合物的降解[12-13]、糖尿病并發(fā)癥及腫瘤發(fā)生[2,14-15]等過程都有醛酮還原酶超家族的參與。

相對于哺乳動物，關(guān)于魚類的醛酮還原酶基因及其功能的研究國內(nèi)外鮮有報道。國外有學(xué)者研究了苯并芘處理尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)后其肝組織醛酮還原酶 AKR1A1 基因的表達情況，認(rèn)為尼羅羅非魚的 AKR1A1 分子可能在苯并芘解毒過程中具有重要的作用[16]。而針對其他魚類尤其是重要淡水養(yǎng)殖品種——黃鱔的醛酮還原酶基因及其功能的報道，目前尚無文獻記載。前期，筆者于實驗室克隆了黃鱔醛酮還原酶基因Eark，并發(fā)現(xiàn)該基因和已知醛酮還原酶家族的成員僅具有約25%的同源性。隨后，筆者構(gòu)建了該基因的原核表達載體，利用Ni離子親和層析柱進行了重組蛋白的分離和純化，并免疫新西蘭兔(Oryctolaguscuniculus)制備了其多克隆抗體并進行了免疫組化和Western blot檢測。該研究結(jié)果對于探究魚類醛酮還原酶基因的功能具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗所用的黃鱔、草魚(Ctenopharyngodonidellus)、黃顙魚(pelteobagrusfulvidraco)，團頭魴(Megalobramaamblycephala)、烏鱧(Ophiocephalusargus、鯽魚(Carassiusaumtus)均購自荊州水產(chǎn)市場；試驗所用的新西蘭純種白兔購自荊州兔業(yè)養(yǎng)殖合作社。pET-28a(+)載體購自 Novagen公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、LA Taq、T4連接酶購于大連寶生物；DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細胞、pEASY-T1載體、蛋白質(zhì)marker購于北京全士金；IPTG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；anti-His一抗、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 購于武漢博士德公司；DAB顯色試劑盒購自于武漢谷歌生物；動物組織總蛋白提取試劑盒購于上海貝博生物；Ni離子親和層系柱購于上海七海生物；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)黃鱔醛酮還原酶基因的cDNA序列(序列號：KF819395)，設(shè)計了一對特異性引物re-ex-F(5′-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3′)和re-ex-R (5′- CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3′)以擴增該基因的成熟肽序列。分別在上、下游引物添加了EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。擴增產(chǎn)物經(jīng)過雙酶切回收純化，與同樣雙酶切的pET-28 a(+)表達載體進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后進行菌液PCR初檢和序列測定驗證，測序正確的質(zhì)粒命名為pET-Eakr。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

取1 ng重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)，涂布于含50 μg/mL的卡那霉素平板上進行37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性轉(zhuǎn)化子于含50 μg/mL的卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、200 r/min搖培至指數(shù)生長期后添加IPTG，使終濃度為0.1 mmol/L，培養(yǎng)3 h。離心收集菌體進行超聲波破碎，然后加入5×上樣緩沖液進行12% SDS-PAGE電泳檢測目標(biāo)蛋白的表達情況。

1.2.3 重組蛋白的純化

將上述陽性菌株按1∶100的比例接種于500 mL含有50 μg/mL的卡那霉素的新鮮液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。離心收集菌體，用50 mmol/L的PBS(pH 8.0)懸浮菌液進行超聲波破碎。超聲波破碎后收集沉淀部分，用裂解緩沖液(6 mol/L鹽酸胍，10 mmol/L咪唑，50 mmol/L PBS pH=8.0)洗滌3次后，加入適量裂解緩沖液溶解，上清液經(jīng)過濾后用1 mL的親和層析鎳柱His-Binding-Resin進行純化，純化的蛋白經(jīng)含6、3、1.5、0.5 mol/L和0.1 mol/L的鹽酸胍緩沖液梯度透析復(fù)性后，使用透析袋濃縮，用BCA法測定蛋白含量。

1.2.4 多克隆抗體的制備

將純化的蛋白和等體積弗氏完全佐劑進行充分乳化后按照200 μg/kg的量采用皮下多點注射法免疫新西蘭大白兔。每次間隔7 d，共注射8次。自第2次免疫開始，用經(jīng)弗氏不完全佐劑充分乳化的抗原進行加強免疫。最后1次加強免疫后1周后采全血分離抗血清，加入30%甘油后，于-20 ℃分裝保存。以第1次免疫前采集的兔血清為陰性對照。

1.2.5 多克隆抗體特異性的Western blot分析

首先將含有空白質(zhì)粒的菌株總蛋白(陰性對照)、陽性菌株總蛋白(陽性對照)和純化的蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。分別用武漢博士德生物有限公司制備的anti-His(1∶2000倍稀釋)及自制的兔抗血清1∶500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進行多抗的特異性檢測。

為進一步分析自制的抗血清的特異性，利用動物組織總蛋白提取試劑盒提取黃鱔肝胰臟、小腸、肌肉和脾臟4種組織的總蛋白。提取方法按照試劑盒說明書進行?？偟鞍滋崛『笕?0 μg各組織總蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上。用制備的抗血清進行1∶500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進行多抗的特異性檢測。

1.2.6 黃鱔醛酮還原酶蛋白的免疫組化分析

采用石蠟包埋法包埋黃鱔的小腸、肝胰臟和脾臟, 以約6 μm厚度進行切片。常規(guī)脫蠟后，用50 μL的H2O2(3%)于37 ℃孵育10 min，阻斷內(nèi)源過氧化物酶。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中并加熱至沸騰，20 min后自然冷卻。用10%山羊血清進行封閉后加入500倍稀釋的兔抗醛酮還原酶抗血清37 ℃溫育2 h，用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水透明及樹膠封片。陰性對照以陰性血清代替一抗。

1.2.7 同源蛋白的Western blot分析

為分析其他不同種魚體內(nèi)是否存在醛酮還原酶的同源蛋白，采用動物組織總蛋白提取試劑盒提取草魚、黃顙魚、團頭魴、烏鱧和鯽魚肝臟總蛋白用于兔抗醛酮還原酶抗血清的同源性蛋白檢測。將50 μg不同種魚來源的肝臟總蛋白進行常規(guī)SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜。用自制的兔抗醛酮還原酶抗血清進行1∶500倍稀釋后作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進行Western blot檢測。

1.2.8 多抗的效價分析

以純化的重組蛋白為包被抗原，以第一次免疫前采集的兔血清為陰性對照，將兔抗Eakr蛋白多克隆抗體進行1∶200至1∶25600倍比稀釋，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，以TMB為底物顯色液，進行間接ELISA分析。以免疫血清樣品D450 nm值/陰性對照血清D450 nm值≥2為陽性作為判定標(biāo)準(zhǔn)，制備的多克隆抗體的最大稀釋度作為該抗體的有效效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達載體的構(gòu)建

利用含有限制性酶切位點的基因特異性引物 re-ex-F 和re-ex-R 從黃鱔肝臟cDNA中可擴增長為1044 bp的條帶，而對重組菌進行的菌液 PCR 擴增的產(chǎn)物大小和預(yù)期相符；隨之，將陽性重組質(zhì)粒用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ進行酶切鑒定，獲得了1條約 1100 bp的條帶和1條約5000 bp長的條帶(圖1)。進一步的測序結(jié)果表明，黃鱔醛酮還原酶序列已經(jīng)成功克隆至 pET-28a(+)中。

圖1 菌液PCR擴增和雙酶切驗證重組質(zhì)粒M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn); 1: PCR擴增結(jié)果; 2: 雙酶切結(jié)果.

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和純化

陽性重組菌經(jīng) 0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后，黃鱔醛酮還原酶在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效融合表達。與對照組相比，陽性重組菌表達了1條蛋白分子量約為 37 ku的重組蛋白，與用軟件預(yù)測的蛋白分子量相符，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了原核表達載體。經(jīng)過Ni親和層析柱分離純化得到了含有His標(biāo)簽的重組蛋白(圖2)。

圖2 黃鱔醛酮還原酶蛋白小量表達SDS-PAGE檢測CK1:陰性對照; CK2:陽性對照; 1: 重組質(zhì)粒誘導(dǎo); 2: 純化的黃鱔醛酮還原酶.

2.3 多克隆抗體的特異性檢測

將上述純化的蛋白進行定量后經(jīng)過多次免疫新西蘭大白兔制備了兔抗醛酮還原酶抗血清。采用Western blot的方法檢測了自制抗血清的特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用商品化的anti-His作為一抗，重組菌總蛋白和純化的醛酮還原酶蛋白都可以產(chǎn)生特異性的反應(yīng)，只有1條帶出現(xiàn)，而對照組則未產(chǎn)生反應(yīng)，說明重組蛋白以融合了His標(biāo)簽的形式存在(圖3a)。而自制的兔抗醛酮還原酶抗血清也可以特異性地和純化的蛋白產(chǎn)生1條特異條帶；在和重組菌總蛋白反應(yīng)時產(chǎn)生了1條分子量較小的條帶，可能是過量表達的雜蛋白產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)導(dǎo)致(圖3b)。

為進一步分析多抗是否與黃鱔組織總蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，將制備的多抗血清作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進行了Western Blot分析。結(jié)果表明，來源于肝胰組織、小腸、肌肉和脾臟的總蛋白都可以和自制的兔抗醛酮還原酶抗血清產(chǎn)生特異性的反應(yīng)，而且4種組織里帶型和分子量大小均一致(圖3c)，說明制備的兔多克隆抗體具備良好的特異性和應(yīng)用價值。

2.4 黃鱔體內(nèi)醛酮還原酶蛋白的免疫組化分析

由免疫組化檢測結(jié)果可知，醛酮還原酶蛋白在黃鱔小腸中的整體分布較為分散，且在腸道內(nèi)壁突出的絨毛根部分布相對較多(圖4b)，在肝胰組織和脾臟中分布較為集中，主要在肝胰組織和脾臟中的部分細胞中表達(圖4d，f)。 而陰性對照未檢出醛酮還原酶蛋白的表達，這些結(jié)果表明制備的兔抗醛酮還原酶多克隆抗體特異性較高，具備組織檢測的應(yīng)用價值。

圖3 黃鱔Eark重組蛋白的Western blot檢測1.重組菌總蛋白； 2.純化的黃鱔醛酮還原酶蛋白.a:商品anti-His 作為一抗； b:自制的兔抗醛酮還原酶抗血清作為一抗; c: 組織蛋白檢測.

2.5 其他魚醛酮還原酶同源蛋白的檢測

為進一步驗證制備的兔抗醛酮還原酶抗血清的應(yīng)用價值，將制備的多抗血清作為一抗，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進行了Western Blot檢測草魚等5種淡水魚醛酮還原酶蛋白的同源蛋白的表達情況。結(jié)果表明，所檢測的5種淡水魚的肝臟組織總蛋白都可以特異性的和制備的多抗產(chǎn)生反應(yīng)，且5種魚的醛酮還原酶同源蛋白分子量比較一致，均約37 ku(圖5)，該結(jié)果表明魚類的醛酮還原酶廣泛存在于淡水魚的不同物種，且制備的多抗具有比較高的應(yīng)用價值。

2.6 抗血清的效價分析

純化的重組蛋白多次免疫新西蘭大白兔后獲得的抗血清通過間接 ELISA 方法檢測了其效價，結(jié)果顯示，制備的抗血清效價較高，陽性血清的最高稀釋度為 1∶12800，有效效價達到1∶6400(圖6)。

圖4 抗血清的免疫組化分析a、c、e為陰性對照；b、d、f為抗血清.

圖5 抗血清對醛酮還原酶同源蛋白的Western blot檢測1.草魚； 2.黃顙魚； 3.團頭魴； 4.烏鱧； 5.鯽魚.

圖6 兔抗黃鱔醛酮還原酶抗血清的效價

3 討 論

醛酮還原酶超家族是廣泛分布在生物界的具有輔酶依賴性的氧化還原酶的集合[3-4]?，F(xiàn)報道的醛酮還原酶超家族成員有16個亞家族共約190多個成員[2]。通過輔酶NAD(P)H 提供還原力，醛酮還原酶可以將醛酮類化合物通過加氫的方式還原成相對應(yīng)的醇類化合物，從而降低毒害作用[17]。其底物包括脂肪類醛酮化合物、芳香類化合物、醛糖、兒茶酚胺、甾類、視黃醛、前列腺素、黃曲霉素等[2,8]。有些醛酮還原酶除了參與了機體的疾病發(fā)生過程，還作為重要的防御酶存在[18]。醛酮還原酶抑制劑在癌癥及糖尿病并發(fā)癥臨床治療等方面具有重要的意義，目前已成為研究的熱點[2,19-20]。對于魚類這些低等脊椎動物的醛酮還原酶基因及其功能報道非常匱乏，亟需深入研究。筆者重組表達并制備了黃鱔醛酮還原酶的多克隆抗體，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

原核表達重組基因是研究醛酮還原酶基因功能的重要途徑之一。大腸桿菌醛酮還原酶 AKR15A1 在重組菌株中的過量表達可有效提高菌株對丙酮醛和甘油醛的毒害作用的耐受性，具有重要的羰基解毒作用[21]。通過檢測組織分布也可推測醛酮還原酶的生物學(xué)功能。Macleod等[22]利用 Western blot 技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測出 AKR1B13、1D2 這兩種醛酮還原酶在在小鼠脾、肝、腎和肺等組織中的表達水平以及表達位置分布，推測出其在哺乳動物機體中主要阻止酚類物質(zhì)被氧化。Endo等[12]利用免疫組化檢測出AKR1C15 在細支氣管細胞、肺泡細胞、胃壁細胞、上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞中的表達及分布，并結(jié)合體外底物篩選結(jié)果推斷出 AKR1C15 在小鼠機體內(nèi)主要起到防御有毒羰基化合物毒害作用?？贵w也是從蛋白質(zhì)水平上研究基因功能的重要工具。制備高效價、特異性強的抗體對于研究其抗原基因的表達、定位及其行使的生物學(xué)功能至關(guān)重要[23]。筆者重組表達了黃鱔的醛酮還原酶基因，并制備了其多克隆抗體。用多抗進行的免疫組化檢測顯示黃鱔醛酮還原酶在小腸、肝臟和胰臟的組織分布及表達水平存在很大差異； 而Western blot結(jié)果表明，黃鱔不同組織里的醛酮還原酶分子量相似；同時應(yīng)用制備的多抗檢測其他淡水魚，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)存在著醛酮還原酶的同源蛋白。這說明此類新的醛酮還原酶亞家族成員可能廣泛存在于淡水魚中并且行使著相似的重要生物學(xué)功能。該研究結(jié)果為研究魚類的醛酮還原酶的功能提供了重要參考資料。

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RecombinantExpressionandPolyclonalAntibodyPreparationofanAldo-ketoReductasefromSwampEel

WANG Quanhe1, JIANG Ao2, YANG Zhen1, LI Wei1

( 1.College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2.College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China )

A pair of gene-specific primers were synthesized to isolate the sequence of AKR of swamp eelMonopterusalbusfrom the liver cDNAs to recombinant expression of swamp eel aldo-keto reductase inEscherichiacoliand to prepare polyclonal antibody against it. The purified products were subcloned into expression vector pET-28a(+). Subsequently, the confirmed plasmid pET/Eakr was transformed into BL21(DE3) competent cells. The positive clones were selected and were induced by IPTG. Then, the recombinant protein was purified by one step affinity chromatography with a Ni-NTA agarose column. New Zealand white rabbits were immunized with the purified protein to generate polyclonal antibodies. Western-blotting and immunohistochemistry assay were performed to detect the specificity of the antibody. Indirect ELISA was used to examine the titer of the antibody. The results showed that the antiserum specifically recognized Eakr in four different tissues of swamp eel and reacted with homologous proteins in grass carpCtenopharyngodonidella, yellow catfishPelteobagrusfulvidraco, bluntnose black breamMegalobramaamblycephala, snakeheadChannaargusand crucian carpCarassiusauratus. Immunohistochemistry assay revealed that the antiserum specifically reacted to Eakr in kidney, liver and intestine with antibody titer of about 1∶6400.

swamp eel; aldo-keto reductase; recombinant expression; polyclonal antibody.

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.020

S917

A

1003-1111(2017)06-0804-06

2017-01-13；

2017-03-09.

國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510489007)；濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心開放課題項目(KF2015016).

王全禾(1991—)，男,碩士研究生;研究方向:水產(chǎn)養(yǎng)殖. E-mail: douyuanjinjiao@sina.com.通訊作者:李偉(1976—)，男, 副教授；研究方向:魚類分子生物學(xué). E-mail: wetli@yangtzeu.edu.cn.