國(guó)內(nèi)荷斯坦種公牛HH4遺傳缺陷基因篩查

勞蘭蘭 ，呂小青 ，劉 林 ，肖 煒 ，張 毅 *

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京市畜牧總站，北京 1001070）

國(guó)內(nèi)荷斯坦種公牛HH4遺傳缺陷基因篩查

勞蘭蘭1，呂小青2，劉 林2，肖 煒3，張 毅1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京市畜牧總站，北京 1001070）

HH4是新近在荷斯坦牛中發(fā)現(xiàn)的一種遺傳缺陷，其分子機(jī)理為牛1號(hào)染色體上的GART基因編碼區(qū)內(nèi)的1個(gè)A/C錯(cuò)義突變。該遺傳缺陷呈隱性遺傳、突變等位基因純合時(shí)，導(dǎo)致胚胎早期死亡。本研究針對(duì)HH4建立了基于PCR-RFLP技術(shù)的分子檢測(cè)方法。結(jié)果表明：通過(guò)對(duì)466頭國(guó)內(nèi)荷斯坦種公牛進(jìn)行基因篩查，發(fā)現(xiàn)6頭攜帶者，均可以追溯到共同的祖先公牛Besne Buck。建議我國(guó)今后進(jìn)口荷斯坦種牛時(shí)，對(duì)個(gè)體進(jìn)行系譜分析和遺傳缺陷基因分子檢測(cè)，避免引入有害基因；同時(shí)，對(duì)國(guó)內(nèi)現(xiàn)有荷斯坦公牛群體進(jìn)行HH4篩查，明確標(biāo)注每頭公牛的攜帶狀態(tài)，以便在生產(chǎn)實(shí)踐中合理選種選配。

荷斯坦牛；遺傳缺陷；HH4；PCR-RFLP

近幾十年來(lái)，由于對(duì)產(chǎn)奶性能的高強(qiáng)度選育，荷斯坦牛群體的近交程度不斷增加。根據(jù)美國(guó)奶牛育種委員會(huì)（CDCB）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2000年出生的美國(guó)荷斯坦母牛平均近交系數(shù)為4.55%，2015年為6.58%，以每年約0.13%的速率不斷遞增（https://www.uscdcb.com/eval/summary/inbrd.cfm）。近交的不斷積累也增加了群體內(nèi)遺傳缺陷基因快速擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

最近幾年，隨著基因組數(shù)據(jù)在奶牛育種中的廣泛應(yīng)用，多種新的奶牛遺傳缺陷基因被發(fā)現(xiàn)[1-5]。繼Van Raden等[1]首先在荷斯坦牛中發(fā)現(xiàn)了3種致死的隱性遺傳缺陷單倍型（HH1、HH2和HH3）后，法國(guó)科學(xué)家Fritz等[2]又發(fā)現(xiàn)一種新的隱性致死遺傳缺陷單倍型，純合時(shí)導(dǎo)致胚胎早期死亡，母牛流產(chǎn)，即HH4。對(duì)法國(guó)荷斯坦牛群繁殖紀(jì)錄的統(tǒng)計(jì)分析表明，HH4攜帶者種公牛的女兒如果再與攜帶者公牛交配，青年母牛妊娠率降低5.80%，經(jīng)產(chǎn)母牛妊娠率降低1.74%[2]。通過(guò)對(duì)25頭荷斯坦牛進(jìn)行全基因組測(cè)序，明確了HH4遺傳缺陷單倍型的致病機(jī)理是牛1號(hào)染色體的GART（Glycinamide Ribonucleotide Transformylase）基因編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生A/C突變，導(dǎo)致編碼的氨基酸從天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸。GART基因編碼甘氨酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰基轉(zhuǎn)移酶，在嘌呤的生物合成中起關(guān)鍵作用，發(fā)生突變后GART功能喪失，阻礙嘌呤合成，最終導(dǎo)致胚胎在妊娠早期死亡[2]。

本研究旨在建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的HH4遺傳缺陷分子檢測(cè)方法，同時(shí)篩查國(guó)內(nèi)荷斯坦公牛HH4攜帶者。

1 材料與方法

1.1 樣品 采集466頭中國(guó)荷斯坦種公牛凍精樣品，采用高鹽法從牛凍精中提取基因組DNA[6]。

1.2 PCR-RFLP檢測(cè)方法的建立

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì) 通過(guò)Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)（http://asia.ensembl.org/index.html），查找GART基因的部分序列（BTA1: 1277027-1277427，UMD 3.1），以該序列為模板進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)及酶切位點(diǎn)分析。利用在線酶切位點(diǎn)分析工具NEBcutter（http://tools.neb.com/NEBcutter2/），查找能夠識(shí)別突變位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)MseI特異性識(shí)別AATT序列，可以切開(kāi)野生型等位基因，而不能切開(kāi)突變型基因。利用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），野生型擴(kuò)增片段有3個(gè)MseI酶切位點(diǎn)，將276 bp的片段切為4個(gè)片段（154、59、58、5 bp）；突變型由于A>C突變，導(dǎo)致1個(gè)酶切位點(diǎn)消失，從而只產(chǎn)生3個(gè)片段（154、117、5 bp）。因此通過(guò)觀察酶切產(chǎn)物是否存在117 bp條帶，即可篩查隱性有害基因的攜帶者。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系總體積25 μL：基因組DNA模板50～100 ng，上、下游引物各10 pmol，Taq酶0.75 U，10×Buffer 2.5 μL，dNTP混合物（各2.5 mmol/L）2 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；然后35個(gè)循環(huán)，94℃變性30 s，60℃復(fù)性 30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸7 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè) 制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物3 μL點(diǎn)樣，在TAE緩沖液中120V電壓下電泳20 min。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，為單一的276 bp條帶。

1.2.4 限制性酶切 PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)總體積20 μL ：PCR產(chǎn)物10 μL，MseI內(nèi)切酶10 U，10×Buffer 2 μL，ddH2O 7 μL。在水浴鍋中37℃消化2 h。

1.2.5 酶切產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè) 制作濃度為4%的瓊脂糖凝膠，取每個(gè)樣品的酶切產(chǎn)物4 μL點(diǎn)樣，在TAE緩沖液中110V電壓下電泳25 min。

2 結(jié) 果

本研究設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增條帶單一且清晰，擴(kuò)增片段大小為276 bp，與目的片段大小一致。酶切反應(yīng)后根據(jù)電泳條帶模式，準(zhǔn)確區(qū)分GART基因致死突變的基因型，從而確定遺傳缺陷基因的攜帶者（圖1）。其中，野生型酶切產(chǎn)物具有2個(gè)條帶，分別為154 bp和59 bp（58 bp），而5 bp條帶無(wú)法觀察到；攜帶者酶切產(chǎn)物除了上述2條帶外，還有1個(gè)117 bp的條帶。

通過(guò)對(duì)466頭荷斯坦種公牛進(jìn)行分子檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)6頭攜帶者。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖2所示，攜帶者個(gè)體在基因組物理位置BTA1：1277227（UMD3.1）存在AC套峰，為雜合子；其他個(gè)體該位置均為A，為野生型。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究建立的PCR-RFLP檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

圖1 GART基因隱性有害突變位點(diǎn)的PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果

表1 引物序列信息

圖2 牛GART基因隱性有害突變攜帶者部分PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

利用中國(guó)奶牛數(shù)據(jù)中心（http://www.holstein.org.cn/）以及加拿大奶牛網(wǎng)（https://www.cdn.ca/）的系譜數(shù)據(jù)，對(duì)本研究所篩查到的6頭攜帶者進(jìn)行系譜追溯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都可以追溯到法國(guó)公牛Jocko Besn及其父親Besne Buck（圖3）。

圖3 HH4遺傳缺陷基因攜帶者公牛系譜追溯

3 討 論

HH4是Frizt等[2]發(fā)現(xiàn)的一種荷斯坦牛隱性致死單倍型，該遺傳缺陷可以追溯的最早祖先為法國(guó)公牛Besne Buck（法國(guó)注冊(cè)號(hào)為4486041658），出生于1986年。這是一個(gè)著名的公牛家系，在加拿大CDN奶牛數(shù)據(jù)庫(kù)中（https://www.cdn.ca/），Buck本身有259個(gè)女兒和118個(gè)兒子；其中兒子Jocko Besn（法國(guó)注冊(cè)號(hào)為5694028588），出生于1994年，也是1頭著名公牛，它的兒子被廣泛應(yīng)用[7]。HH4在法國(guó)荷斯坦牛中的頻率為3.6%[2]，但在美國(guó)牛群頻率只有0.37%[8]。說(shuō)明該突變可能主要存在于歐洲荷斯坦牛群中。本研究在我國(guó)466頭荷斯坦種公牛中篩查到HH4攜帶者公牛6頭，提示該缺陷基因在中國(guó)荷斯坦牛中的頻率較低，這可能是由于我國(guó)近年來(lái)主要從北美及澳大利亞引進(jìn)種公牛，而從歐洲引入的公牛較少。

本研究對(duì)6頭HH4攜帶者系譜分析發(fā)現(xiàn)，其中4頭父親為德國(guó)公牛，2頭父親為加拿大公牛，它們都可以追溯到共同祖先Besne Buck和Jocko Besn，由此推斷中國(guó)荷斯坦牛群體中的HH4是在荷斯坦牛的進(jìn)口過(guò)程中帶入的。為了降低HH4遺傳缺陷對(duì)中國(guó)荷斯坦牛群體的危害，應(yīng)積極采取相應(yīng)的措施。建議今后進(jìn)口荷斯坦種牛時(shí)，應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的系譜分析，檢測(cè)個(gè)體的HH4攜帶情況，避免引入遺傳缺陷基因；其次，對(duì)國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的荷斯坦公牛群體，應(yīng)進(jìn)行HH4分子檢測(cè)，明確標(biāo)注每頭公牛的攜帶狀態(tài)，以便在生產(chǎn)實(shí)踐中合理選配[9]，避免雜合子交配造成的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究建立的PCR-RFLP檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單方便，在普通的分子實(shí)驗(yàn)室就能完成，且成本較低，可以用于國(guó)內(nèi)荷斯坦牛HH4遺傳缺陷的常規(guī)分子檢測(cè)。

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Carrier Screening for Genetic Defect HH4 in Chinese Holstein Bulls

LAO Lan-lan1, LV Xiao-qing2, LIU Lin2, XIAO Wei3, ZHANG Yi1*
(1.College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China;2.Beijing Dairy Cattle Center, Beijing 100192, China;
3
. Beijing General Station of Animal Husbandry, Beijing 100012, China)

HH4 is an autosomal recessively inherited disorder recently identi fi ed in Holstein cattle. The molecular mechanism of HH4 has been identi fi ed as a A/C missense mutation inGARTgene on chromosome 1(BTA1), which leads to loss of gene function. The embryo with homozygous defective alleles will die during early pregnancy. In the current study, a polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was established to detect carriers of HH4 in 466 Chinese Holstein bulls. As a result, six carrier were identi fi ed, indicating a low frequency of HH4 carriers in Chinese Holstein population. In order to reduce economic loss caused by HH4, pedigree analysis and molecular assay should be performed before the genetic materials of Holstein cattle are introduced into China. Meanwhile, all active Chinese Holstein bulls should be routinely screened for HH4 and labeled in the pedigree, which allows a more effective mating program.

Holstein; Genetic defect; HH4; PCR-RFLP

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-033

2017-05-30；

2017-07-13

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD28B02）；北京市奶牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（BAIC06-2017）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-37）

勞蘭蘭（1991-），女，山東濱州人，碩士研究生，E-mail：laolanlan1991@163.com；并列第一作者，呂小青（1981-），女，山西人，博士研究生，E-mail：13810787287@139.com

*通訊作者：張毅（1979-），副教授，E-mail：yizhang@cau.edu.cn