飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸、直腸菌群結(jié)構(gòu)及主要菌群數(shù)量的影響

楊桂芹 王 琪 劉海英 董維國 朱 鑫

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866)

飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸、直腸菌群結(jié)構(gòu)及主要菌群數(shù)量的影響

楊桂芹 王 琪 劉海英 董維國 朱 鑫

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸和直腸菌群結(jié)構(gòu)和主要菌群數(shù)量的影響。采用單因素完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，選用300只1日齡愛拔益加肉仔雞，隨機(jī)分成5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。5組肉仔雞分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對(duì)照組)、0.5、1.5、2.5和5.0 g/kg菊糖的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為6周。采用PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)和定量PCR(qPCR)技術(shù)對(duì)42日齡肉仔雞盲腸和直腸菌群結(jié)構(gòu)及主要菌群數(shù)量進(jìn)行測定。結(jié)果表明：1)飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸和直腸菌群豐富度、盲腸菌群香農(nóng)指數(shù)以及直腸菌群均勻度均無顯著影響(P>0.05)，但顯著降低了盲腸菌群均勻度和直腸菌群香農(nóng)指數(shù)(P<0.05)。PCR-DGGE圖譜上部分優(yōu)勢條帶序列分析表明，飼糧添加菊糖促進(jìn)了肉仔雞盲腸和直腸厚壁菌門(Firmicutes)中產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)、腸單胞球菌(Intestinimonassp.)和盲腸腸球菌(Enterococcuscecorum)等細(xì)菌的增殖。2)飼糧菊糖添加水平顯著影響了肉仔雞盲腸、直腸總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量(P<0.05)。二次曲線分析顯示，當(dāng)菊糖添加水平分別為2.71和2.66 g/kg時(shí)，盲腸總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量最少；與對(duì)照組相比，飼糧添加1.5、2.5、5.0 g/kg菊糖顯著降低了盲腸乳酸菌數(shù)量(P<0.05)，飼糧添加0.5 g/kg菊糖顯著增加了直腸乳酸菌數(shù)量(P<0.05)；飼糧添加5.0 g/kg菊糖時(shí)肉仔雞盲腸、直腸雙歧桿菌數(shù)量及直腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量均為最高，且與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。綜上，在本試驗(yàn)條件下，有利于改善肉仔雞腸道菌群結(jié)構(gòu)和促進(jìn)有益菌增殖的菊糖添加水平為2.5～5.0 g/kg。

菊糖；菌群結(jié)構(gòu)；菌群數(shù)量；腸道；肉仔雞

腸道微生物及其代謝對(duì)肉仔雞的營養(yǎng)、健康與疾病具有重要的影響和調(diào)控作用，通過營養(yǎng)方式干預(yù)宿主腸道微生物健康已經(jīng)成為動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。菊糖對(duì)肉仔雞腸道的有益功能已經(jīng)得到廣泛證實(shí)，其應(yīng)用也日益受到重視[2-3]。菊糖，也稱菊粉，是通過D-果糖分子經(jīng)β(1→2)糖苷鍵連接而成(果聚糖)，主要來源于菊芋和菊苣塊根中。菊糖無味、無固定形態(tài)，易溶于水，熔點(diǎn)高達(dá)178 ℃，相對(duì)體積質(zhì)量1.35，有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。孫瑞鋒等[4]研究表明，飼糧添加3 g/kg的菊糖可使肉仔雞盲腸大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量分別降低14.50%和36.42%，有效減少了肉仔雞排泄物氨氣散發(fā)量。研究發(fā)現(xiàn)，來源于菊苣根中的菊糖顯著促進(jìn)了肉仔雞回腸和盲腸雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌的繁殖[5]；隨著菊糖添加量的增加，公豬大腸和糞中糞臭素濃度隨之減少，而產(chǎn)氣莢膜梭菌在結(jié)腸和直腸的數(shù)量降低，并推測糞臭素濃度的減少可能與產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的減少、中短鏈脂肪酸含量的增加有關(guān)[6]。然而，另外的研究表明，飼糧添加菊糖對(duì)肉仔雞腸道菌群無顯著影響[7]。本課題組前期研究結(jié)果表明，飼糧添加菊糖不影響肉仔雞的生產(chǎn)性能，但添加5.0 g/kg的菊糖顯著降低了肉仔雞排泄物、盲腸和直腸吲哚和糞臭素濃度[8]，為進(jìn)一步研究其對(duì)肉仔雞腸道菌群的影響，特進(jìn)行飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸、直腸菌群結(jié)構(gòu)及主要菌群數(shù)量影響的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及飼糧

試驗(yàn)用菊糖為上海某公司生產(chǎn)，純度>92%，相對(duì)分子質(zhì)量近似5 000，為白色結(jié)晶粉末，無味?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型粉狀料，其組成及營養(yǎng)水平同文獻(xiàn)[8]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，選取300只1日齡愛拔益加肉仔雞，隨機(jī)分為5組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。Ⅰ組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5、1.5、2.5、5.0 g/kg菊糖的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)雞采用3層全階梯籠養(yǎng)，熱風(fēng)爐供暖，人工喂料，乳頭飲水器供水，機(jī)械清糞，自由采食和飲水，試驗(yàn)期為6周。按常規(guī)方法進(jìn)行疫苗接種和飼養(yǎng)管理。

1.3 樣品采集

肉仔雞飼養(yǎng)至42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)取1只雞(確保每組3雄3雌)，頸靜脈放血處死，迅速解剖，分離盲腸和直腸，液氮速凍后，保存在-80 ℃條件下，備測。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 菌群結(jié)構(gòu)

1)DNA提取。盲腸和直腸樣本在4 ℃冰箱解凍后，每2只雞(1雌1雄)的盲腸、直腸分別混合后，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法分別提取15個(gè)盲腸、15個(gè)直腸樣本基因組DNA。

2)細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增：以樣品基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物GC-338F(5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，下劃線部分為GC夾)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)擴(kuò)增樣品16S rDNA的V3區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL、rTaq(5 U/μL)0.4 μL、GC-338F(20 μmol/L)1 μL、518R(20 μmol/L)1 μL、模板DNA 50 ng，補(bǔ)雙蒸水(ddH2O)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

3)PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中56 V、60 ℃條件下電泳16 h。DGGE完畢后，采用銀染法染色。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction試劑盒純化回收。采用Quantity one分析軟件包對(duì)DGGE圖譜的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析。依據(jù)戴斯系數(shù)(Cs)構(gòu)建聚類圖，主成分分析(PCA)采用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行。

計(jì)算公式如下：

式中：Cs、H、S和E分別代表戴斯系數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、豐富度和均勻度；Nx為x泳道條帶數(shù)；Ny為y泳道條帶數(shù)；j為2個(gè)泳道共有的條帶數(shù)；pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率；N為單一泳道上所有條帶的密度；Ni為第i條帶的密度；Hmax是H的最大值。

4)DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序。用滅菌手術(shù)刀完整切下DGGE圖譜中條帶清晰、分離明顯的優(yōu)勢條帶。以2 μL回收產(chǎn)物為模板，338F/518R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到PMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，得到條帶所代表的細(xì)菌類型。

1.4.2 主要菌群數(shù)量

總細(xì)菌、大腸桿菌、乳酸菌和雙歧桿菌引物序列同文獻(xiàn)[9]。產(chǎn)氣莢膜梭菌引物序列為：上游引物5′-GGGTTTCAACACCTCCGTG-3′，下游引物5′-CGATTAAGAGTAATGCAAGG-3′。取0.5 μL基因組DNA進(jìn)行定量PCR(qPCR)反應(yīng)。采用20 μL體系(10 μL 2×SG PCR MasterMix，上游引物、下游引物(10 μmoL/L)各0.5 μL，0.5 μL基因組DNA，8.5 μL ddH2O)，在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國)上擴(kuò)增。

反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s。用1%的瓊脂糖凝膠電泳確定有特異擴(kuò)增后，再擴(kuò)增2個(gè)50 μL體系的PCR，進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體。測序正確的質(zhì)粒測定濃度，根據(jù)分子質(zhì)量計(jì)算拷貝數(shù)，并進(jìn)行梯度稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1.4.1中提取的樣本DNA稀釋10倍后上熒光定量PCR儀上檢測，操作過程同標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建。根據(jù)樣品Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品菌群數(shù)量，再換算成每克樣品中細(xì)菌拷貝數(shù)的lg值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

以重復(fù)為單位進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)過程進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，并利用Contrast中的線性和二次項(xiàng)進(jìn)行趨勢分析。P<0.05為差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉仔雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)

由圖1可知，15個(gè)盲腸樣品共有50條條帶。M1-1～M5-3樣本中含有的條帶數(shù)目分別為20、18、20、18、19、21、19、16、11、19、15、21、18、18、18條。由表1可知，飼糧菊糖添加水平對(duì)盲腸菌群香農(nóng)指數(shù)和豐富度無顯著影響(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ組盲腸菌群均勻度顯著低于對(duì)照組和Ⅱ組(P<0.05)。飼糧菊糖添加水平(x)與肉仔雞盲腸菌群均勻度(y)呈顯著的二次曲線關(guān)系(P<0.05)，回歸方程為y=0.243x2-0.136x+0.974(R2=0.671 7)，當(dāng)飼糧菊糖添加水平為2.8 g/kg時(shí)，肉仔雞盲腸菌群均勻度最小，為0.950。

M1-1、M1-2、M1-3來自Ⅰ組 M1-1, M1-2 and M1-3 come from group Ⅰ；M2-1、M2-2、M2-3來自第Ⅱ組 M2-1, M2-2 and M2-3 come from group Ⅱ；M3-1、M3-2、M3-3來自Ⅲ組 M3-1, M3-2 and M3-3 come from group Ⅲ；M4-1, M4-2 and M4-3來自Ⅳ組 M4-1, M4-2 and M4-3 come from group Ⅳ；M5-1、M5-2、M5-3來自Ⅴ組 M5-1, M5-2 and M5-3 come from group Ⅴ。圖2、圖3同 The same as Fig.2 and Fig.3。

圖1肉仔雞盲腸菌群PCR-DGGE指紋圖譜

Fig.1 PCR-DGGE fingerprints of microbiota in cecum of broilers

2.2 肉仔雞盲腸菌群相似性

PCR-DGGE圖譜的PCA見圖2。主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為21.4%、15.6%，二者共解釋了37.0%的DGGE圖譜信息。PC1將樣本分為左右兩部分，Ⅲ組和Ⅳ組樣本被分在左半部分，對(duì)照組和Ⅴ組樣本被分在右半部分，Ⅱ組樣本存在于兩側(cè)。PC2將樣本分為上下兩部分，Ⅱ組樣本被分在上半部分，Ⅲ組樣本被分在下半部分，對(duì)照組樣本除M1-2在中間外全部在上邊，Ⅳ組樣本除M4-1外全部在下邊，Ⅴ組除M5-3外全部在下邊。結(jié)合PC1與PC2進(jìn)行分析，與其他樣本離散性最大的是M1-1，說明該樣本與其他樣本腸道菌群相似性最低。

表1 飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same column, values with the same or without letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖3為依據(jù)樣本的Cs構(gòu)建的聚類圖，在15個(gè)樣本中，來自對(duì)照組的樣本M1-1與其他樣本相似性最低，相似性系數(shù)為0.44。相似性高的有4簇，分別為M1-2與M1-3、M2-2與M2-3、M5-1與M5-3、M3-3與M4-1，相似性系數(shù)分別為0.73、0.76、0.66、0.65。樣本M1-2、M1-3為同一簇(來自對(duì)照組)，M5-1、M5-3為同一簇(來自Ⅴ組)，這兩簇的相似性較低(相似性系數(shù)為0.59)，說明菊糖對(duì)肉仔雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。這與PCA結(jié)果相似。

圖2 盲腸菌群DGGE圖譜條帶的PCA

圖3 盲腸菌群UPGMA相似性分析

2.3 肉仔雞盲腸菌群DGGE圖譜優(yōu)勢條帶序列分析

試驗(yàn)對(duì)盲腸DGGE指紋圖譜中具有共性、特異性的10條條帶進(jìn)行了回收、克隆和測序。由表2可知，所有序列與GenBank中16S rDNA序列的相似性在87%～100%。除15號(hào)條帶的相似菌來自擬桿菌門(Bacteroidetes)外，其余均來自厚壁菌門(Firmicutes)。37號(hào)條帶為M4-1、M4-3、M5-2共有條帶，其所代表的序列的最相似菌為真細(xì)菌屬中的產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌(Eubacteriumcoprostanoligenes)，相似度為95%。16、18號(hào)條帶為各組共有條帶，其所代表的相似菌分別是Dielmafastidiosa和Faecalibacteriumprausnitzii，相似度分別為87%和96%。

表2 肉仔雞盲腸菌群DGGE圖譜優(yōu)勢條帶的序列分析結(jié)果

2.4 肉仔雞直腸菌群結(jié)構(gòu)

由圖4可知，Z1-1～Z5-3樣本中含有的條帶數(shù)目分別是24、21、19、15、19、19、11、9、14、17、13、27、18、14、15條。由表3可知，飼糧菊糖添加水平對(duì)直腸菌群均勻度和豐富度均無顯著影響(P>0.05)，Ⅲ組直腸菌群香農(nóng)指數(shù)顯著低于除Ⅴ組之外的其余各組(P<0.05)。

Z1-1、Z1-2、Z1-3來自Ⅰ組 Z1-1, Z1-2 and Z1-3 come from group Ⅰ；Z2-1、Z2-2、Z2-3來自Ⅱ組 Z2-1, Z2-2 and Z2-3 come from group Ⅱ；Z3-1、Z3-2、Z3-3來自Ⅲ組 Z3-1, Z3-2 and Z3-3 come from group Ⅲ；Z4-1、Z4-2、Z4-3來自Ⅳ組 Z4-1, Z4-2 and Z4-3 come from group Ⅳ；Z5-1、Z5-2、Z5-3來自Ⅴ組 Z5-1, Z5-2 and Z5-3 come from group Ⅴ。圖5、圖6同 The same as Fig.5 and Fig.6。

圖4肉仔雞直腸菌群PCR-DGGE指紋圖譜

Fig.4 PCR-DGGE fingerprints of microbiota in rectum of broilers

表3 飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞直腸菌群多樣性的影響

2.5 肉仔雞直腸菌群相似性

肉仔雞直腸菌群PCR-DGGE圖譜PCA見圖5。PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為20.6%、14.6%，共解釋了34.60%的DGGE圖譜信息。PC1將樣本分為左右兩部分，對(duì)照組、Ⅱ組全部在右側(cè)，Ⅲ、Ⅴ組全部在左側(cè)，Ⅳ組兩側(cè)都存在。PC2將樣本分為上下兩部分，對(duì)照組全部在上邊，Ⅱ和Ⅴ組全部在下邊，Ⅲ和Ⅳ組上下都存在。Z3-3和Z4-1距離最為緊密。距離最遠(yuǎn)的是Z5-2和Z1-2(分別來自Ⅴ組和對(duì)照組)。由圖6可知，15個(gè)樣本中，相似性較高的有3簇，分別為Z4-1與Z3-3、Z1-1與Z1-3、Z3-1與Z4-1、Z3-3，相似系數(shù)分別為0.72、0.64、0.60。與其余樣本相似系數(shù)最低的是Z5-2，相似系數(shù)僅為0.27。上述結(jié)果表明Ⅴ組與其余4個(gè)組直腸菌群相似性最低。

圖5 直腸菌群DGGE圖譜條帶的PCA

圖6 直腸菌群UPGMA相似性分析

2.6 肉仔雞直腸菌群DGGE圖譜優(yōu)勢條帶序列分析

本試驗(yàn)回收了6條直腸菌群DGGE圖譜具有共性、特異性的條帶，進(jìn)行克隆和測序。由表4可知，各序列和GenBank中16S rDNA序列的相似性在95%～100%。2號(hào)條帶為Z3-1、Z3-3、Z4-1共有的條帶，其所代表的最相似菌為腸單胞球菌(Intestinimonassp.)，相似度為95%。33號(hào)條帶為Z2-3、Z3-1、Z4-3、Z5-1共有條帶，其序列所代表的最相似菌為盲腸腸球菌(Enterococcuscecorum)，相似度為100%。36號(hào)條帶為Z2-2、Z2-3、Z4-3共有條帶，其所代表的最相似菌為普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)，相似度為96%。45號(hào)條帶為Z2-3、Z5-3共有條帶，其序列所代表的最相似菌為蘇德式芽孢梭菌(Clostridiumsordelli)，相似度為100%。

表4 直腸菌群DGGE圖譜優(yōu)勢條帶的序列分析結(jié)果

2.7 肉仔雞盲腸菌群數(shù)量

由表5可知，各試驗(yàn)組盲腸總細(xì)菌、大腸桿菌數(shù)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組盲腸乳酸菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組和Ⅱ組(P<0.05)；Ⅱ、Ⅴ組盲腸雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組及Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05)，以Ⅴ組盲腸雙歧桿菌數(shù)量最多。飼糧菊糖添加水平對(duì)盲腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量無顯著影響(P>0.05)。除雙歧桿菌外，盲腸各細(xì)菌數(shù)量與飼糧菊糖添加水平均呈顯著的線性關(guān)系(P<0.05)；同時(shí)，盲腸總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量與飼糧菊糖添加水平呈顯著的二次曲線關(guān)系(P<0.05)，當(dāng)飼糧菊糖添加水平分別為2.71和2.66 g/kg時(shí)，盲腸總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量最少。

表5 飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸主要菌群數(shù)量的影響

2.8 肉仔雞直腸菌群數(shù)量

由表6可知，Ⅲ、Ⅴ組直腸總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組及Ⅱ、Ⅳ組(P<0.05)。Ⅱ組直腸乳酸菌數(shù)量顯著高于其他各組(P<0.05)。Ⅴ組直腸雙歧桿菌數(shù)量最多，顯著高于對(duì)照組及Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05)。Ⅴ組直腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量顯著高于其余各組(P<0.05)。除大腸桿菌外，直腸各細(xì)菌數(shù)量與菊糖添加水平均呈顯著的線性關(guān)系(P<0.05)；同時(shí)，直腸雙歧桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量與飼糧菊糖添加水平呈顯著的二次曲線關(guān)系(P<0.05)，當(dāng)飼糧菊糖添加水平為2.96 g/kg時(shí)，直腸雙歧桿菌數(shù)量最少。

表6 飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞直腸主要菌群數(shù)量的影響

3 討 論

3.1 飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸和直腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

通過PCR-DGGE圖譜中條帶的位置、數(shù)量和亮度等可綜合反映腸道菌群的多樣性。Rehman等[7]研究表明，在玉米-豆粕型飼糧中添加10 g/kg的菊糖對(duì)42日齡肉仔雞空腸和盲腸菌群DGGE圖譜條帶數(shù)量及菌群多樣性指數(shù)無顯著影響。Yang等[10]研究表明，飼糧添加1.2 g/kg的菊糖不顯著影響肉仔雞盲腸菌群多樣性、豐富度和均勻度。體外試驗(yàn)也證實(shí)，添加菊糖對(duì)肉仔雞盲腸、直腸食糜發(fā)酵液中菌群多樣性和豐富度的影響均不顯著，但發(fā)酵液中DGGE圖譜條帶數(shù)量有所降低[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加菊糖對(duì)肉仔雞盲腸、直腸菌群DGGE圖譜條帶數(shù)量均無顯著影響，但各菊糖添加組條帶數(shù)不同程度低于對(duì)照組，且多樣性指數(shù)均有所降低；但添加一定量的菊糖后顯著降低了肉仔雞盲腸菌群均勻度和直腸菌群香農(nóng)指數(shù)，該結(jié)論與以上報(bào)道略有差異。這與PCR-DGGE技術(shù)的局限性(如DNA的提取效率、DNA的提取和純化方法以及PCR擴(kuò)增過程的誤差等)有關(guān)。另外，采用DGGE技術(shù)只能對(duì)優(yōu)勢菌群進(jìn)行檢測與分析。本試驗(yàn)聚類分析和PCA表明，盲腸菌群對(duì)照組的M1-2、M1-3與5.0 g/kg菊糖添加組的M5-1、M5-3樣本的相似性僅為0.59；而直腸菌群中，與其余樣本相似性系數(shù)最低的是Z5-2，僅為0.27。上述結(jié)果說明飼糧添加菊糖影響了肉仔雞盲腸和直腸菌群的組成。本試驗(yàn)對(duì)DGGE圖譜優(yōu)勢菌群序列分析表明，飼糧添加菊糖后，DGGE圖譜出現(xiàn)了不同的優(yōu)勢條帶。盲腸樣本的37號(hào)條帶僅存在于菊糖添加組，其序列所代表的是厚壁菌門的Eubacteriumcoprostanoligenes，說明添加菊糖能促進(jìn)該菌生長。直腸樣本2、33、36、45號(hào)條帶也只存在于菊糖添加組，其序列所代表的是厚壁菌門的球菌或梭菌類細(xì)菌，說明添加菊糖促進(jìn)了直腸中以上細(xì)菌的生長，此結(jié)果與Yang等[10]報(bào)道的飼糧添加1.2 g/kg的菊糖有助于不可培養(yǎng)的厚壁菌門毛螺菌科(uncultured Lachnospiraceae)及不可培養(yǎng)的擬桿菌門(uncultured Bacteroidetes)細(xì)菌增殖的結(jié)果基本一致。

3.2 飼糧菊糖添加水平對(duì)肉仔雞盲腸和直腸主要菌群數(shù)量的影響

家禽腸道微生物一般分為兩大類，即有害菌(病源菌)和有益菌(病源菌抑制菌)。有害菌主要包括大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌等，而乳酸菌和雙歧桿菌被認(rèn)為是腸道有益菌[12-13]。有益菌的增加會(huì)降低有害菌在腸道中的發(fā)酵[14]。有關(guān)飼糧添加菊糖對(duì)肉仔雞腸道菌群數(shù)量影響的結(jié)果不完全一致。林晨[15]發(fā)現(xiàn)，菊糖能夠調(diào)節(jié)肉仔雞腸道內(nèi)微生物菌群，且菊粉添加水平越高，大腸桿菌數(shù)量越少，雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量越多。Nabizadeh[16]研究表明，飼糧添加10 g/kg的菊糖顯著降低了肉仔雞盲腸大腸桿菌數(shù)量。Zhao等[17]研究表明，飼糧添加2.5和5.0 g/kg的果聚糖顯著提高了31日齡肉公雞盲腸乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量，降低了盲腸大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，并降低了排泄物氨的散發(fā)量。Kareem等[18]研究表明，乳酸菌代謝物——益生素(postbiotics)分別與0.8%、1.0%的菊糖混合添加顯著提高了42日齡肉仔雞排泄物乳酸菌的數(shù)量，降低了腸桿菌(Enterobacteriaceae)數(shù)量。但另外的研究則表明菊糖對(duì)腸道菌群數(shù)量無顯著影響，如Biggs等[19]報(bào)道，在玉米-豆粕型飼糧中添加4 g/kg的菊糖對(duì)21日齡肉仔雞盲腸乳酸菌、雙歧桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸桿菌數(shù)量均無顯著影響。Abdel-Raheem等[20]也證明，益生素和合生素對(duì)肉仔雞盲腸乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量無顯著影響。不過，Abdelqader等[21]研究表明，菊糖雖然沒有顯著增加產(chǎn)蛋雞回腸、盲腸中乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量，但顯著減少了回腸、盲腸大腸桿菌數(shù)量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加1.5、2.5、5.0 g/kg菊糖顯著降低了盲腸乳酸菌數(shù)量，但添加0.5 g/kg菊糖顯著增加了直腸乳酸菌數(shù)量；飼糧添加1.5、5.0 g/kg菊糖顯著降低了盲腸、直腸總細(xì)菌和大腸桿菌數(shù)量，但添加5.0 g/kg菊糖顯著增加了盲腸、直腸雙歧桿菌數(shù)量；飼糧添加菊糖對(duì)肉仔雞盲腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量無顯著影響，但添加5.0 g/kg菊糖顯著增加了直腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。本試驗(yàn)所得結(jié)果與上述報(bào)道不完全一致，這與試驗(yàn)所用雞的日齡、性別、取樣部位、菊糖來源、結(jié)構(gòu)與劑量等不同有關(guān)。另外，菊糖的益生效果也與肉仔雞的飼養(yǎng)環(huán)境和個(gè)體因素有很大的關(guān)系[5]。本試驗(yàn)中，5.0 g/kg菊糖添加組在促進(jìn)有益菌增殖的同時(shí)，也同樣促進(jìn)了直腸有害菌(產(chǎn)氣莢膜梭菌)的增殖，說明飼糧中添加高水平的菊糖不利于控制有害菌的增殖。菊糖的益生作用主要是源于其特殊的結(jié)構(gòu)不能被家禽的胃和胰分泌的消化酶所消化，而是進(jìn)入后腸被有益菌如乳酸菌、雙歧桿菌所利用，產(chǎn)生短鏈脂肪酸和乳酸[22-23]，進(jìn)而降低了有毒代謝物(氨、吲哚、酚類等)的產(chǎn)生[24]。

綜上，飼糧添加菊糖降低肉仔雞排泄物、盲腸和直腸吲哚和糞臭素濃度[8]主要是通過調(diào)整菌群結(jié)構(gòu)，降低腸道總細(xì)菌、大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加適宜水平的菊糖顯著降低了肉仔雞盲腸菌群均勻度和直腸菌群香農(nóng)指數(shù)，促進(jìn)了肉仔雞盲腸和直腸厚壁菌門Eubacteriumcoprostanoligenes、Intestinimonassp.和Enterococcuscecorum等細(xì)菌增殖。

② 飼糧添加適宜水平的菊糖顯著降低了肉仔雞盲腸、直腸總細(xì)菌和直腸大腸桿菌數(shù)量，增加了直腸乳酸菌、盲腸和直腸雙歧桿菌及直腸產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。

③ 在本試驗(yàn)條件下，肉仔雞飼糧菊糖適宜添加水平為2.5～5.0 g/kg。

[1] 馬曦,韓萌,李德發(fā).豬腸道微生物代謝與思考[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十二次動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2016:3-14.

[2] DANKOWIAKOWSKA A,KOZOWSKA I,BEDNARCZYK M.Probiotics,prebiotics and snybiotics in poultry-mode of action,limitation,and achievements[J].Journal of Central European Agriculture,2013,14(1):467-478.

[4] 孫瑞鋒,步長英,李同樹.菊糖和枯草芽孢桿菌對(duì)肉雞腸道菌群數(shù)量及排泄物氨氣散發(fā)量的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2008,23(S1):252-256.

[5] REBOLé A,ORTIZ L T,RODRGUEZ M L,et al.Effects of inulin and enzyme complex,individually or in combination,on growth performance,intestinal microflora,cecal fermentation characteristics,and jejunal histomorphology in broiler chickens fed a wheat and barley-based diet[J].Poultry Science,2010,89(2):276-286.

[6] VHILE S G,KJOS N P,S?RUM H,et al.Feeding jerusalem artichoke reduced skatole level and changed intestinal microbiota in the gut of entire male pigs[J].Animal,2012,6(5):807-814.

[7] REHMAN H,HELLWEG P,TARAS D,et al.Effects of dietary inulin on the intestinal short chain fatty acids and microbial ecology in broiler chickens as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis[J].Poultry Science,2008,87(4):783-789.

[8] 王琪,管倩侽,楊桂芹,等.飼糧添加菊糖對(duì)肉仔雞生長性能、排泄物及腸道主要臭氣化合物濃度的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28(12):3875-3884.

[9] 張沛.肉仔雞糞臭素產(chǎn)生的基本規(guī)律及與腸道微生物組成的變化關(guān)系研究[D].碩士學(xué)位論文.沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[10] YANG G Q,YIN Y,LIU H Y,et al.Effects of dietary oligosaccharide supplementation on growth performance,concentrations of the major odor-causing compounds in excreta,and the cecal microflora of broilers[J].Poultry Science,2016,95(10):2342-2351.

[11] 侯瑞.菊糖和大豆寡糖對(duì)體外條件下肉仔雞糞臭素產(chǎn)量及腸道菌群的影響[D].碩士學(xué)位論文.沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[12] LOPES M,ROLL V F B,LEITE F L,et al.Quicklime treatment and stirring of different poultry litter substrates for reducing pathogenic bacteria counts[J].Poultry Science,2013,92(3):638-644.

[13] DE PAIVA J B,LEITE J L,DA SILVA L P M,et al.Influence of the major nitrite transporter NirC on the virulence of a Swollen Head Syndrome Avian PathogenicE.coli(APEC) strain[J].Veterinary Microbiology,2015,175(1):123-131.

[14] HAJATI H,REZAEI M.The application of prebiotics in poultry production[J].International Journal of Poultry Science,2010,9(3):298-304.

[15] 林晨.菊粉對(duì)斷奶仔豬和肉仔雞后腸微生物作用的研究[D].碩士學(xué)位論文.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[16] NABIZADEH A.The effect of inulin on broiler chicken intestinal microflora,gut morphology,and performance[J].Animal Feed Science and Technology,2012,21(4):725-734.

[17] ZHAO P Y,WANG J P,KIM I H.Effect of dietary levan fructan supplementation on growth performance,meat quality,relative organ weight,cecal microflora,and excreta noxious gas emission in broilers[J].Journal of Animal Science,2013,91(11):5287-5293.

[18] KAREEM K Y,LOH T C,FOO H L,et al.Effects of dietary postbiotic and inulin on growth performance,IGF1 andGHRmRNA expression,faecal microbiota and volatile fatty acids in broilers[J].BMC Veterinary Research,2016,12:163.

[19] BIGGS P,PARSONS C M,FAHEY G C.The effects of several oligosaccharides on growth performance,nutrient digestibilities,and cecal microbial populations in young chicks[J].Poultry Science,2007,86(11):2327-2336.

[20] ABDEL-RAHEEM S M,ABD-ALLAH S M S,HASSANEIN K M A.The effects of prebiotic,probiotic and synbiotic supplementation on intestinal microbial ecology and histomorphology of broiler chickens[J].International Journal for Agro Veterinary and Medical Sciences,2012,6(4):277-289.

[21] ABDELQADER A,AL-FATAFTAH A R,DAG，et al.Effects of dietaryBacillussubtilisand inulin supplementation on performance,eggshell quality,intestinal morphology and microflora composition of laying hens in the late phase of production[J].Animal Feed Science and Technology,2013,179(1/2/3/4):103-111.

[22] SAMANTA A K,SENANI S,KOLTE A P,et al.Effect of prebiotic on digestibility of total mixed ration[J].Indian Veterinary Journal,2012,89(1):41-42.

[23] MIREMADI F,SHAH N P.Applications of inulin and probiotics in health and nutrition[J].International Food Research Journal,2012,19(4):1337-1350.

[24] SAMANTA A K,JAYAPAL N,SENANI S,et al.Prebiotic inulin:useful dietary adjuncts to manipulate the livestock gut microflora[J].Brazilian Journal of Microbiology,2013,44(1):1-14.

EffectsofInulinSupplementalLevelonMicrobialCommunityStructureandMainMicrobialPopulationsinCecumandRectumofBroilers

YANG Guiqin WANG Qi LIU Haiying DONG Weiguo ZHU Xin

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110866,China)

The purpose of this experiment was to study the effects of inulin supplemental level on microbial community structure and main microbial populations in cecum and rectum of broilers. Three hundred 1-day-old Arbor Acres broilers were selected and randomly distributed into five groups with six replicates per group and ten broilers per replicate by single-factor completely random design. Broilers in those five groups were fed a basal diet supplemented with 0 (control group), 0.5, 1.5, 2.5 and 5.0 g/kg inulin, respectively. The experiment lasted for 6 weeks. The microbial community structure and the main microbial populations in cecum and rectum of 42-day-old broilers were measured using the PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and quantitative PCR (qPCR) techniques. The results showed as follows: 1) inulin supplemental level had no significant effects on the cecal and rectal microbial richness, the cecal microbial Shannon-Wiener index and the rectal microbial evenness of broilers (P>0.05), but significantly decreased the cecal microbial evenness and rectal microbial Shannon-Wiener index (P<0.05). Based on the analysis of some dominant bands in PCR-DGGE fingerprint, diet supplemented with inulin promoted the growth ofEubacteriumcoprostanoligenes,Intestinimonassp.,Enterococcuscecorumand so on from Firmicutes in cecum and rectum of broilers. 2) Diet supplemented with inulin significantly affected the populations of total bacteria andEscherichiacoliin cecum and rectum of broilers (P<0.05). Quadratic curve analysis showed that the populations of total bacteria andEscherichiacoliwere the fewest in cecum of broilers when inulin supplemental levels were 2.71 and 2.66 g/kg, respectively. Compared with control group, diet supplemented with 1.5, 2.5 and 5.0 g/kg inulin significantly decreased the population of cecalLactobacillus(P<0.05), while diet supplemented with 0.5 g/kg inulin significantly increased the population of rectalLactobacillus(P<0.05). The populations of cecal and rectalBifidobacteriaand rectalClostridiumperfringenswere the most when diet supplemented with 5.0 g/kg inulin, and the differences were significant compared with control group (P<0.05). Thus, results from the current study suggest that supplementation of 2.5 to 5.0 g/kg inulin to basal diet may have the beneficial effects on improving the microbial community and promoting the growth of beneficial bacteria in intestine of broilers under this experimental condition.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(12)：4408-4418]

inulin; microbial community; microbial population; intestine; broilers

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.12.021

S831.5

A

1006-267X(2017)12-4408-11

2017-06-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372328)

楊桂芹(1966—)，女，遼寧凌源人，教授，博士，從事家禽營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail: guiqiny@126.com

Author, YANG Guiqin, professor, E-mail: guiqiny@126.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)