高壓氧治療對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后Nogo—A及NgR表達(dá)的影響

涂杳然+牛凡+洪德全+胡勇

[摘要]目的 探討高壓氧治療對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后Nogo-A及NgR表達(dá)的影響。方法 選取SPF級(jí)SD大鼠100只，利用Feeney自由落體撞擊法制成急性中度創(chuàng)傷性腦損傷模型，將模型隨機(jī)分為治療組（n=20）和損傷組（n=80）。損傷組不做特殊處理、治療組建模成功后進(jìn)行高壓氧治療。觀察兩組大鼠創(chuàng)傷后第1、3、5、7、10天時(shí)間段內(nèi)大鼠腦內(nèi)Nogo-A及NgR的表達(dá)差異。結(jié)果 治療組、損傷組大鼠均在創(chuàng)傷后第3天的Nogo-A及NgR表達(dá)最高，治療組大鼠的Nogo-A及NgR的表達(dá)在創(chuàng)傷后第1、3、5、7、10天的Nogo-A及NgR表達(dá)均低于損傷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 高壓氧治療對(duì)下調(diào)Nogo-A及NgR表達(dá)是促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]高壓氧治療；創(chuàng)傷性腦損傷；Nogo-A及NgR表達(dá)；大鼠

[中圖分類號(hào)] R749.16 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）11（c）-0007-03

Influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats

TU Yao-ran NIU Fan HONG De-quan HU Yong

Trauma Center，Third Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330008，China

[Abstract]Objective To investigate the influence of hyperbaric oxygen therapy on the expression of Nogo-A and NgR after traumatic brain injury in rats.Methods One hundred SD rats （SPF grade） were selected and established as acute moderate traumatic brain injury models using Feeney′s method.The models were randomly divided into treatment group （n=20） and injury group （n=80）.In the injury group，no special treatment was applied，while in the treatment group，hyperbaric oxygen was adopted after successful modeling.The differences in the expression of Nogo-A and NgR in rats 1，3，5，7 and 10 days after the trauma of rats in two groups were observed.Results The expression of Nogo-A and NgR were highest in the third day after trauma in both the treatment and injury groups.The Nogo-A and NgR expression in the treatment group were all lower than those in the injury group 1，3，5，7 and 10 days after the trauma，and the differences were statistically significant （P<0.01）.Conclusion Down-regulation of Nogo-A and NgR expression by hyperbaric oxygen is one of the mechanisms of promoting central nerve regeneration.

[Key words]Hyperbaric oxygen therapy；Traumatic brain injury；Nogo-A and NgR expression；Rats

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)抑制因子-A（neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A）與其受體（nogo receptor，NgR）結(jié)合后可抑制軸突生長(zhǎng)，主要通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路引或改變胞內(nèi)鈣離子濃度實(shí)現(xiàn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用高壓氧治療創(chuàng)傷性腦損傷（TBI），可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能有不同程度的改善，但其機(jī)制并不明確[2]。因此本研究考察高壓氧治療對(duì)大鼠中度創(chuàng)傷性腦損傷后不同時(shí)間段腦內(nèi)Nogo-A和NgR受體表達(dá)的影響，探討高壓氧治療對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)功能的影響及創(chuàng)傷時(shí)間與Nogo-A、NgR表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠100只，體重（250±30）g，20～25℃室溫下培養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)、自由進(jìn)食、進(jìn)水，自然光照。

1.2試劑

sABC試劑盒，DAB顯色試劑盒，兔抗Nogo-A IgG，兔抗NgR，以上試劑均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3儀器

大型高壓氧艙，由解放軍九四醫(yī)院提供；動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)備，手術(shù)器械，麻醉藥品，熒光顯微鏡，免疫熒光分析儀，F(xiàn)eeney撞擊裝置，組織切片機(jī)等儀器均由南昌市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室及病理科提供。endprint

1.4方法

1.4.1腦損傷大鼠模型的制備 將損傷組、治療組的大鼠制成急性中度創(chuàng)傷性腦損傷模型，用10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠；麻醉滿意后將大鼠固定于操作臺(tái)上，剪掉頭頂毛發(fā)，用7%酒精消毒皮膚，沿矢狀縫切開(kāi)2 cm切口，剝離皮下組織及顱骨骨膜，用電鉆在硬膜外、冠狀縫后1.5 mm，矢狀縫右側(cè)2.5 mm處開(kāi)一個(gè)直徑5 mm骨窗，去除骨殘片，生理鹽水沖洗。采用自由落體致傷撞擊裝置，根據(jù)Feeney法，將撞擊桿頭端至于骨窗內(nèi)，保持撞擊桿與地面垂直，于30 cm高度處將20 g撞擊錘釋放，沖擊撞桿，撞擊鼠腦。撞擊完成后迅速抬起撞擊桿。若發(fā)生出血，用棉球輕按至止血。清理術(shù)野，間斷縫合切口。先將大鼠轉(zhuǎn)移至保暖墊上，待出現(xiàn)身體活動(dòng)后，再移回鼠籠。將模型隨機(jī)分為治療組（n=20）和損傷組（n=80），損傷組又隨機(jī)分為創(chuàng)傷后第1天（n=16）、第3天（n=16）、第5天（n=16）、第7天（n=16）和第10天（n=16）5個(gè)小組。

1.4.2高壓氧治療 建模成功后，將治療組大鼠放入高壓氧治療箱的高壓氧艙行高壓氧治療。

1.4.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) ①腦組織切片制作：用10%水合氯醛將大鼠過(guò)量麻醉，確定大鼠無(wú)痛覺(jué)反應(yīng)后，用室溫生理鹽水和4℃的4%多聚甲醛行心臟灌流。灌流完成后打開(kāi)顱腔取下大腦，運(yùn)用鋒利薄刀片切取大小約為1 mm的腦組織，切片時(shí)注意切勿擠壓與用力。將所取腦組織浸入3%戊二醛溶液中進(jìn)行固定。固定后用磷酸鹽緩慢沖洗3次，每次10 min，緩慢沖洗后運(yùn)用四氧化鋨進(jìn)行再次固定2 h，然后再次運(yùn)用磷酸鹽緩慢沖洗3次，每次10 min；后脫水，在丙酮與包埋劑1：1的條件下進(jìn)行浸透，然后進(jìn)行包埋聚合，運(yùn)用硝酸鉛與醋酸鈾染色，染色后裱于膠質(zhì)包被的載玻片上，烘干后于常溫陰暗干燥處保存?zhèn)溆?。②免疫組化測(cè)定大鼠創(chuàng)傷灶邊緣Nogo-A及NgR蛋白：取所制腦組織切片，運(yùn)用二甲苯、乙醇脫蠟，在3%雙氧水中孵育15 min，蒸餾水沖洗3 min；PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，每次3 min。在高壓熱下進(jìn)行抗原修復(fù)；修復(fù)后再次PBS洗滌3次。配置并滴加一抗40～50 μl置入37℃烤箱內(nèi)孵育1 h，然后室溫下放置30 min并PBS洗滌3次。滴加二抗，同樣于37℃烤箱內(nèi)孵育1 h，再次PBS洗滌3次。BAB顯色，自來(lái)水洗滌，脫水、封片。在普通顯微鏡下觀察結(jié)果，利用熒光顯微鏡成像攝片，用Image J軟件將結(jié)果量化。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠創(chuàng)傷灶邊緣不同時(shí)間段Nogo-A表達(dá)的比較

在創(chuàng)傷后第3天，兩組大鼠腦內(nèi)Nogo-A表達(dá)最高，治療組大鼠的Nogo-A表達(dá)在創(chuàng)傷后第1、3、5、7、10天均明顯低于損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.2兩組大鼠創(chuàng)傷灶邊緣不同時(shí)間段NgR表達(dá)的比較

創(chuàng)傷后第3天，兩組大鼠腦內(nèi)NgR表達(dá)最高，治療組大鼠在創(chuàng)傷后第1、3、5、7、10天的腦內(nèi)NgR表達(dá)均明顯低于損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表2）。

3討論

Nogo-A蛋白是存在于髓鞘中的一種軸突再生抑制因子[3]。研究證明，Nogo蛋白的編碼基因?yàn)閚ogo，屬于網(wǎng)狀蛋白質(zhì)家族，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。Nogo-A由1個(gè)Nogo蛋白共有的188個(gè)氨基酸羧基末端以及2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)巨大的氨基末端組成。Nogo-A具有2個(gè)抑制性功能結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是跨膜環(huán)狀Nogo-66，位于細(xì)胞，另一個(gè)是較長(zhǎng)的氨基端區(qū)（amino-Nogo），定位于胞質(zhì)內(nèi)[4-5]。

NgR是Nogo-A的特異性受體，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在灰質(zhì)中含量最高[6-7]。NgR由1個(gè)肽信號(hào)、8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列、1個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)序列羧基端和1個(gè)糖基磷脂酰肌醇偶聯(lián)跨膜區(qū)組成[8]。

多種造模研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A抗體或NgR拮抗劑后，可明顯下調(diào)Nogo-A和NgR的表達(dá)，可促使中樞神經(jīng)軸突再生，對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)有重要意義[9-10]。研究表明，成年恒河猴單側(cè)頸髓損傷后運(yùn)用Nogo-A抗體可明顯使其運(yùn)動(dòng)功能得到恢復(fù)。也有研究證明，Nogo-66拮抗劑可治療大鼠脊髓損傷，促進(jìn)大鼠中樞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，恢復(fù)大鼠功能。此外，還有相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，運(yùn)用NgR疫苗法，使大鼠體內(nèi)產(chǎn)生NgR抗體，可對(duì)受損的中樞神經(jīng)其明顯恢復(fù)作用[11-13]。大量實(shí)驗(yàn)表明，在創(chuàng)傷性腦損傷中，Nogo-A及NgR的異常表達(dá)貫穿整個(gè)過(guò)程[14]。

隨著科技發(fā)展，高壓氧療法已被廣泛運(yùn)用與腦外傷治療中，且受廣大學(xué)者關(guān)注，因其療效明確，目前已成為腦外傷后重要的輔助治療手段[15]。本研究中，運(yùn)用高壓氧對(duì)腦損傷后大鼠進(jìn)行治療，明顯降低了大鼠腦內(nèi)Nogo-A及NgR的表達(dá)水平，從而減輕腦水腫，促進(jìn)中樞神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)。研究結(jié)果提示，兩組大鼠在腦損傷后第3天的Nogo-A及NgR表達(dá)最高，而后逐漸降低，且治療組所有時(shí)間段內(nèi)Nogo-A及NgR的表達(dá)水平均低于損傷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

綜上所述，高壓氧治療下調(diào)Nogo-A及NgR的表達(dá)水平，是促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的機(jī)制之一，因?qū)嶒?yàn)所選研究樣本數(shù)量較少，研究結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)一步研究探討。

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（收稿日期：2017-09-19 本文編輯：孟慶卿）endprint