厚殼貽貝(Mytilus coruscus)金屬硫蛋白MT-10:cDNA克隆、結(jié)構(gòu)分析及銅離子脅迫下的表達*

王昊盛 宋鑫金 董文強 吳 斌 陳永霞 盧瑋筱 祁鵬志 郭寶英

(浙江海洋大學 國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)金屬硫蛋白MT-10:cDNA克隆、結(jié)構(gòu)分析及銅離子脅迫下的表達*

王昊盛 宋鑫金 董文強 吳 斌 陳永霞 盧瑋筱 祁鵬志①郭寶英

(浙江海洋大學 國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

近年來我國沿海海域重金屬污染日趨嚴重, 軟體動物尤其是雙殼貝類響應重金屬污染脅迫的研究發(fā)展成為目前的研究熱點。金屬硫蛋白是一類廣泛存在于生物體內(nèi)富含半胱氨酸(Cys)的小分子蛋白, 具有結(jié)合金屬離子的能力, 能有效調(diào)節(jié)生物體細胞內(nèi)的金屬離子平衡, 具有清除自由基,重金屬解毒的功能, 關于厚殼貽貝MT蛋白的研究尚未見報道。本文首次利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術(shù)克隆了厚殼貽貝 MT-10蛋白 cDNA全長(Mc-MT-10), 其包含 101bp的 5′ UTR區(qū),108bp的3′UTR區(qū)以及222bp的ORF區(qū), 編碼73個氨基酸。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)Mc-MT-10富含Cys, 且具有9個軟體動物中常見的CXC結(jié)構(gòu)以及CKCXXXCXCX結(jié)構(gòu), 系統(tǒng)進化樹中同科或?qū)僦蠱T-10聚合成一個分支, 顯示出高度保守性。采用Q-PCR技術(shù)分析了MT-10 mRNA在Cu2+脅迫下厚殼貽貝外套膜及消化腺中表達變化, 結(jié)果表明Mc-MT-10mRNA在Cu2+脅迫下兩種組織中的表達量急劇升高, 說明Cu2+能夠誘導Mc-MT-10mRNA的表達, 并且表現(xiàn)出誘導具有閾值性特點。研究結(jié)果可為深入研究厚殼貽貝MT蛋白的功能奠定基礎, 為厚殼貽貝抗重金屬污染新品種選育提供數(shù)據(jù)支持。

厚殼貽貝; 金屬硫蛋白基因; 熒光定量PCR; 銅脅迫

厚殼貽貝(Mytilus coruscus), 屬貽貝目(Mytiloida)、貽貝科(Mytilidae)、貽貝屬(Mytilus), 是海洋雙殼貝類中生長速度最快的種類之一。主要分布于我國黃渤海、東海、臺灣等地, 在日本北海道、韓國濟州島等地也有分布。隨著工業(yè)進程的不斷深入,給沿海海域環(huán)境帶來巨大壓力, 工業(yè)廢水、船舶油污、生活污水等造成的海水污染不斷加劇, 許多重金屬嚴重超標(郭遠明等, 2012)。重金屬不易降解, 在食物鏈中不斷富集, 人類食用富含重金屬的魚蝦貝等海產(chǎn)品會產(chǎn)生中毒現(xiàn)象, 對健康危害極大(Shuaiet al,2001)。雙殼貝類對重金屬具有較強的生物富集能力,且活動性低, 是天然的重金屬污染指示物。其在重金屬脅迫下的變化可間接反映在高濃度金屬離子脅迫下生物機體內(nèi)的氧化反應程度, 是指示環(huán)境污染的重要標志(Mooreet al, 2004)。貽貝作為重金屬污染指示物在很多國家已經(jīng)得到應用(Miller, 1999), 相關基礎研究也逐漸得到重視。但現(xiàn)階段國內(nèi)外對貽貝的研究主要集中于翡翠貽貝與紫貽貝, 對厚殼貽貝的研究主要集中在人工育苗養(yǎng)殖(?？姑赖? 2007), 遺傳特異性(Yeet al, 2012)以及營養(yǎng)成分比對分析(Kimet al, 2012)等方面。本研究旨在填補貽貝屬中厚殼貽貝的作為重金屬污染指示物研究, 為今后對厚殼貽貝進行更加全面深入的科研提供基礎。

金屬硫蛋白(metallothioneins, MT)是一種富含半胱氨酸(Cys)及金屬離子的小分子蛋白。通常含有CC、CXC等結(jié)構(gòu), 因為半胱氨酸(Cys)能與重金屬離子結(jié)合因而取名金屬硫蛋白, 在一定程度上起到重金屬解毒和自由基清除等修復作用(劉維青等, 2006)。MT蛋白在生物體內(nèi)的的表達水平通常也反映了該生物對重金屬的應激及自我修復能力, 同時也能作為環(huán)境中重金屬濃度的指示物。近年來國內(nèi)外已經(jīng)出現(xiàn)了許多關于生物體內(nèi)MT的報道(Wanget al, 2011), 主要集中于各種魚類(Olssonet al, 1998; Roevaet al,1999)和水生無脊椎動物(Roesijadiet al, 1991), 以及大量的軟體動物(Isaniet al, 1997; Langstonet al, 1998)和甲殼動物(Roesijadiet al, 1997; Engelet al, 1993;Barka, 2000)。但厚殼貽貝 MT基因的研究尚未見報道。本研究通過 RACE技術(shù)克隆了厚殼貽貝 MT-10全長cDNA序列, 通過銅離子脅迫, 模擬當前海洋環(huán)境重金屬污染現(xiàn)狀, 通過對厚殼貽貝細胞內(nèi) MT-10 mRNA相對表達量的測定及分析, 論證厚殼貽貝遭遇重金屬污染之后的應激行為及對重金屬的自我修復能力, 為厚殼貽貝今后作為海洋環(huán)境中重金屬濃度指示物提供理論基礎。同時也為解決當前厚殼貽貝養(yǎng)殖業(yè)面對海洋重金屬污染的困境提供一定建議。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本次實驗所用的厚殼貽貝(Mytilus coruscus)于2016年10月采集于舟山東極青浜島附近海域, 外殼平均長度為(9.25±0.43)cm, 殼寬(4.51±0.3)cm, 殼高(3.05±0.20)cm, 濕重(60.18±6.45)g。清污后置于藍色養(yǎng)殖桶內(nèi)暫養(yǎng), 每天換取經(jīng)過過濾的海水, 10d之后選擇生命特征明顯的個體進行對照實驗。

1.2 方法

1.2.1 銅離子脅迫 將選擇后的厚殼貽貝隨機分為兩組, 每組 40只。實驗組海水中加入硫酸銅作為銅離子源, 使 Cu2+終濃度為 20μg/L。每天換水一次,更新一半并在實驗組中添加硫酸銅維持Cu2+濃度。

1.2.2 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 處理后2d、5d、10d、15d、21d、28d進行取樣。對照組和實驗組隨機取出4個的厚殼貽貝, 解剖得到外套膜及消化腺存放于–80°C冰箱內(nèi)暫存。采集厚殼貽貝腮、性腺、消化腺、血細胞、腎臟、肌肉及外套膜組織, 存放于–80°C冰箱內(nèi)暫存。待樣品全部采集完成之后帶回實驗室提取總RNA。RNA提取采用常規(guī)TRIzol RNA提取方法進行, RNA提取完成后立即進行逆轉(zhuǎn)錄, 逆轉(zhuǎn)錄步驟參考RevertAidTMFirst StrandcDNA Synthesis Kit說明書。

1.2.3 引物設計及Mc-MT-10全長cDNA克隆 通過NCBI查找并下載已知的雙殼貝類MT蛋白氨基酸序列并進行序列比對, 在保守區(qū)設計一對特異引物MT-F: ATGSCTGCACCTTGTAACTGYATY, MT-R:TCAYTTGCAGGARCANCCAGRTKC, 克隆Mc-MT-10基因部分 cDNA片段, 并送武漢轉(zhuǎn)導生物科技有限公司進行Race測序。

1.2.4Mc-MT-10熒光定量分析 逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板稀釋后作為Q-PCR的模板, 以厚殼貽貝β-actin為內(nèi)參, MT-F、MT-R為引物進行Q-PCR實驗, 分析Mc-MT-10組織表達譜及銅離子脅迫下的表達變化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析 運用最小二乘法 2–ΔΔCt法(Livaket al, 2001)處理Q-PCR數(shù)據(jù), 以溶解曲線判定擴增產(chǎn)物的特異性, 利用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析, 采用單因子方差分析顯著性差異。通過Oligin軟件對數(shù)據(jù)進行處理并導出柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mc-MT-10基因分析

經(jīng)Race測序獲得Mc-MT-10基因cDNA全長序列(圖 1), 注冊序列號為 KX987251。該序列全長為431bp, 包含 101bp的 5′-UTR 區(qū), 108bp的 3′-UTR區(qū),ORF區(qū)全長為 222bp, 推導其編碼 73個氨基酸。預測其分子量為72.81kDa, 等電點為7.24。其分子式為C274H460N86O101S22, 含 943個原子。預測分子量大小和等電點分別為76.11kDa和9.027, 原子總數(shù)10747,分子式 C3365H5400N950O1005S27, 不穩(wěn)定系數(shù) 44.34。用Clustal W 軟件將Mc-MT-10氨基酸序列與其他物種MT-10序列進行比對(圖2), 發(fā)現(xiàn)19個保守的Cys, 其中9對Cys與其相鄰的氨基酸構(gòu)成9個CXC結(jié)構(gòu)。另外, CKCXXXCXCX結(jié)構(gòu)也是軟體動物金屬硫蛋白常見的保守結(jié)構(gòu), 在Mc-MT-10蛋白序列中也發(fā)現(xiàn)存在一個類似結(jié)構(gòu)域。

圖1 厚殼貽貝MT-10基因cDNA及氨基酸序列Fig.1 The whole sequence of cDNA and deduced amino acid sequence of Mc-MT-10

圖2 MT-10蛋白氨基酸多序列比對Fig.2 The multiple alignments of amino acid sequences of MT-10s

構(gòu)建了基于Neighbor-joining的系統(tǒng)進化樹, boot值為5000(圖3)。在進化樹中,Mc-MT-10首先與同屬物種M.galloprovincialis的MT-10聚合在一起, 通過單序列比對,Mc-MT-10與Mg-MT-10核苷酸相似度為93.15%。而后與同屬或科中的同源物聚合成一個大的分支, 與脊椎動物的相距較遠。厚殼貽貝MT-10的進化地位與厚殼貽貝的生物學分類地位基本一致, 顯示了較強的保守性。

2.2 Mc-MT-10基因組織表達分析

用qRT-PCR技術(shù)檢測了Mc-MT-10基因在厚殼貽貝腮、肌肉、消化腺、外套膜、血細胞、性腺和腎臟等組織中的表達情況, 結(jié)果表明Mc-MT-10基因在各組織中均有表達, 在消化腺中的表達量最高, 其次為腮、血細胞和腎臟, 在肌肉、外套膜和性腺中的表達量最低(圖4)。

2.3 銅離子脅迫下Mc-MT-10基因表達分析

用qRT-PCR技術(shù)檢測了厚殼貽貝外套膜和消化腺Mc-MT-10基因在Cu2+脅迫下的表達情況(圖5, 圖6)。實驗結(jié)果表明: 銅離子脅迫下, 外套膜和消化腺Mc-MT-10基因呈現(xiàn)類似的表達模式。處理 2d時,Mc-MT-10基因表達量顯著升高, 5d時, 表達量達到峰值, 而后逐漸下降, 處理15d時, 消化腺Mc-MT-10基因表達量已回落至正常水平, 實驗結(jié)束時(28d),外套膜Mc-MT-10基因表達量回落至接近正常水平。但兩種組織Mc-MT-10基因表達量變化并不完全相同,外套膜中Mc-MT-10基因表達量變化顯著高于消化腺。

3 討論

金屬硫蛋白一類廣泛存在于生物界的低分子量蛋白, 富含半胱氨酸, 由于Cys巰基能共價結(jié)合金屬離子, 是金屬結(jié)合位點, 因此其對多種重金屬, 如銅、鎘及鋅具有高度親和性, 可參與生物體中對金屬元素的解毒過程(Coyleet al, 2002)。本研究中, 厚殼貽貝MT-10蛋白含有19個Cys殘基, 含量達26.0%,顯示其發(fā)達的金屬結(jié)合能力, 這與在其他軟體動物的報道相一致(Engelkenet al, 1999; 呂達等, 2012)。CXC結(jié)構(gòu)是軟體動物MT蛋白的顯著特征, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝MT-10蛋白含有9個CXC結(jié)構(gòu), 經(jīng)序列比對, 發(fā)現(xiàn)此類 CXC結(jié)構(gòu)在軟體動物 MT蛋白中的高度保守。有研究認為, 軟體動物MT蛋白還存在保守的CKCXXXCXCX結(jié)構(gòu)(Imagawaet al, 1990), 本研究發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝 MT-10蛋白也存在一個這樣的結(jié)構(gòu)域, 同大部分軟體動物的發(fā)現(xiàn)相一致, 但在海灣扇貝(Argopecten irradians)MT蛋白中卻存在兩個類似結(jié)構(gòu), 而且其包含145個氨基酸, Cys含量高達27.6, 顯示了更強的重金屬結(jié)合能力, 可能是兩物種進化過程所處環(huán)境差異造成的,A.irradians在進化過程中所面對的重金屬環(huán)境壓力更大(劉維青等, 2006)。基于Neighbor-joining的系統(tǒng)進化樹表明厚殼貽貝 MT-10的進化地位與厚殼貽貝的生物學分類地位基本一致,顯示了較強的保守性。

圖3 基于Neighbor Joining的系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogenetic tree constructed based on Neighbor Joining method

厚殼貽貝MT-10的組織表達譜表明, MT-10在各組織中是廣泛存在的, 顯示其廣泛參與各類生命活動。而在消化腺以及腮、血細胞和腎臟中的表達量較高, 在軟體動物中此類組織均為重要的免疫組織, 參與對外界刺激的應急、防御及免疫調(diào)控等, 進一步表明MT-10蛋白在厚殼貽貝中發(fā)揮重要的防御作用。

一些學者認為, 生物體內(nèi)MT蛋白響應重金屬脅迫呈現(xiàn)倒“U”型模式(Hermeszet al, 2001; Chanet al,2004; Wuet al, 2006), MT蛋白適應重金屬脅迫有一個劑量閾值, 即當重金屬達到某一濃度時, 金屬硫蛋白會隨重金屬劑量增加而上升, 一旦超出該濃度閾值, 重金屬就會對生物體產(chǎn)生不可逆的毒性, 金屬硫蛋白水平就會隨重金屬水平增加而降低。本研究發(fā)現(xiàn),隨著處理時間的不斷延長, MT-10蛋白的表達量逐漸升高, 到達峰值后逐步回落。在組織細胞吸收的銅離子劑量不斷增加的情況下, 確實出現(xiàn)了典型的倒“U”型模式。研究結(jié)果表明, 在20μg/L銅離子脅迫下, 厚殼貽貝細胞內(nèi)銅離子濃度閾值出現(xiàn)的時間在 5d, 5d后MT-10蛋白的表達量就逐漸下降, 15d后其表達量回落至正常水平。

圖4 厚殼貽貝MT-10 mRNA組織表達譜Fig.4 The tissues distributions of MT-10 mRNA in M.coruscus

圖5 銅離子脅迫下厚殼貽貝外套膜組織MT-10 mRNA表達變化Fig.5 The expression analysis of MT-10 mRNA in mantle of M.coruscus under Cu2+ stress

圖6 銅離子脅迫下厚殼貽貝消化腺組織MT-10 mRNA表達變化Fig.6 The expression analysis of MT-10 mRNA in digestive glands of M.coruscus under Cu2+ stress

4 結(jié)論

厚殼貽貝作為一種具有重要經(jīng)濟價值的海洋雙殼貝類, 其作為環(huán)境指示生物的作用近年來也逐漸引起人們重視。本研究首次克隆了厚殼貽貝 MT-10蛋白全長cDNA序列, 分析其結(jié)構(gòu)特征, 并對其響應重金屬脅迫的 mRNA表達變化進行了初步研究。研究結(jié)果可為深入研究厚殼貽貝 MT蛋白的功能奠定基礎, 為厚殼貽貝抗重金屬污染新品種選育提供數(shù)據(jù)支持, 為降低貽貝養(yǎng)殖業(yè)風險提供了重要依據(jù)。

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THE CDNA CLONING AND CHARACTERIZATION OFMYTILUS CORUSCUSMETALLOTHIONEIN 10 AS WELL AS ITS MRNA EXPRESSION UNDER THE CU2+STRESS

WANG Hao-Sheng, SONG Xin-Jin, DONG Wen-Qiang, WU Bin,CHEN Yong-Xia, LU Wei-Xiao, QI Peng-Zhi, GUO Bao-Ying
(Zhejiang Ocean University,National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture,Zhoushan316022,China)

In this paper, a 413bp full-length cDNA sequence of metallothionein 10 from thick shell mussel was obtained with RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends (RACE) technique (so called ‘Mc-MT-10’ thereafter).It consists of a 101bp 5′untranslated region (UTR), an 222bp open reading frame (ORF) and a 108bp 3′UTR.The translated protein is composed of 73 amino acids.The multiple alignments showed the abundant Cys residues, 9 conserved CXC domains and one CKCXXXCXCX domain, in addition, theMc-MT-10cluster into one branch with the counterparts from congeneric species in the phylogenetic tree, suggesting the high evolutionary conservation.The Q-PCR assays were employed to assess the relative expressive changes ofMc-MT-10mRNA in mantle and digestive gland under the stress of copper ions.The results showed that the expression levels ofMc-MT-10mRNA rose sharply under the stress of Cu2+,implying that theMc-MT-10could involve in the regulation of thick hell mussel against Cu2+stress.

Mytilus coruscus; metallothionein; Real-time fluorescence quantitative PCR; Cu2+stress

Q789; Q955

10.11693/hyhz20170300056

*浙江省公益項目, 2017C32009號; 浙江海洋大學科研啟動資金項目, 21105013615號。王昊盛, E-mail: wanghaosheng1234@163.com

① 通訊作者: 祁鵬志, 博士, 助理研究員, E-mail: qpz2004@sina.com

2017-03-15, 收修改稿日期: 2017-04-03