長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫力功能作用的研究

王欣宇，車成來(lái)，林花，王霞，王宇輝，玄東哲，金龍哲

(延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133001)

長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫力功能作用的研究

王欣宇，車成來(lái)，林花，王霞，王宇輝，玄東哲，金龍哲*

(延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133001)

研究長(zhǎng)白山地區(qū)靈芝提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的影響。實(shí)驗(yàn)以4個(gè)劑量組經(jīng)口灌胃，將小鼠隨機(jī)分為高、中、低3進(jìn)行灌胃，空白組以等量蒸餾水處理，給小鼠連續(xù)給藥30d，對(duì)小鼠進(jìn)行細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)的測(cè)定。結(jié)果表明，長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物具有提高免疫力功能的作用。

長(zhǎng)白山地區(qū)；有機(jī)靈芝；免疫功能

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與劑量選擇

樣品由延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)特產(chǎn)品加工研究所提供。昆明種雄性小鼠由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK-(吉)2013-0001。成人劑量以60kg體質(zhì)量攝入1.2g/60kg·bw·d，相當(dāng)于人體攝入劑量的1、10和30倍，即0.02、0.2、0.6g/kg·bw·d，各劑量組以蒸餾水稀釋。以蒸餾水為空白對(duì)照組，每組12只，每只小鼠灌胃量為0.2mL/10g·bw·d，灌胃30d，并測(cè)定其各項(xiàng)免疫指標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1 臟器/體重比值測(cè)定。將小鼠處死后，取脾臟和胸腺后稱重，分別計(jì)算其脾臟/體重比值以及胸腺/體重比值。

1.2.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法DTH)。生理鹽水洗滌羊血洗滌3次，腹腔免疫用2%(V/V)SRBC進(jìn)行腹腔注射，每只注射免疫0.2mL(相當(dāng)于1×108個(gè)SRBC)，待免疫4d時(shí)測(cè)量小鼠左后足跖的厚度，在測(cè)量足跖部位處皮下注射20%SRBC，每只小鼠注射20μL，24h后繼續(xù)測(cè)量其左后足跖的厚度，測(cè)量3次，取平均值。

1.2.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法)。將取無(wú)菌Hank’s液的小平皿，將脾置于其中，磨碎后制成單個(gè)細(xì)胞懸液。放于Hank’s液洗滌2次，離心，將細(xì)胞置于完全培養(yǎng)液(1mL)使其懸浮，臺(tái)酚蘭染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，將其濃度調(diào)至為3×108個(gè)/mL。每個(gè)細(xì)胞懸液分為兩個(gè)孔，每孔1mL加入24孔板中，一組作為對(duì)照組，一孔加75μL ConA液，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。在培養(yǎng)68h時(shí)，將每孔輕輕吸去0.7mL的上清液，并加入吸去相同量的RPMI 1640培養(yǎng)液(不含小牛血清)，同時(shí)每孔加入50μL 5mg/mL的MTT，培養(yǎng)4h。當(dāng)培養(yǎng)完畢，加入1mL酸性異丙醇，使紫色潔凈溶解至完全溶解后，導(dǎo)入2mL比色杯中，測(cè)OD值。

1.2.4 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)。小鼠進(jìn)行尾靜脈注射印度墨汁(1∶4倍稀釋)，注射后立刻計(jì)時(shí)。當(dāng)注射2、10min時(shí)，在內(nèi)眥靜脈叢中取血20μL，并置于2mL的0.1%Na2CO3溶液中。測(cè)OD值，以Na2CO3溶液作為空白組。

1.2.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。2000r/min離心壓積雞紅細(xì)胞10min，小鼠腹腔注射20%懸液1mL，30min后將小鼠處死，取其體內(nèi)巨噬細(xì)胞洗液1mL，滴至墊有濕紗布的載玻片上，放于盒內(nèi)并移至孵箱37 ℃溫育20min。孵畢，用生理鹽水洗凈未貼片細(xì)胞。待晾干后，甲醇固定，4%(V/V)Giemsa-磷酸緩沖液染色，生理鹽水洗凈，晾干備用。油鏡下按照每片100個(gè)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，吞噬百分率或吞噬指數(shù)代表小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

1.2.6 NK細(xì)胞活性測(cè)定(乳酸脫氫酶LDH測(cè)定法)。取靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞各100μL，分別加入96孔板中，向靶細(xì)胞釋放孔分別加100μL的靶細(xì)胞和100μL的培養(yǎng)液，靶細(xì)胞最大釋放孔分別加入100μL靶細(xì)胞、1%NP40，分別設(shè)有3個(gè)平行孔，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃ 培養(yǎng)4h，離心，每孔吸取100μL的上清液，待反應(yīng)10min后，向每孔加入30μL 的1molHCl溶液，使其反應(yīng)終止，測(cè)OD值，計(jì)算NK活性。

2 結(jié)果

表1 受試樣品對(duì)小鼠臟器/體重比值的影響

表2 受試樣品對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

表3 受試樣品對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

表4 受試樣品對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清作用的影響

表5 受試樣品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

按不同劑量連續(xù)給予小鼠受試樣品長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物30d，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，小鼠臟器/體重比值、淋巴細(xì)胞的增殖能力、碳廓清功能、吞噬率、吞噬指數(shù)在0.02、0.2、0.6g/kg組與空白組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，足跖腫脹度在中、高劑量組均高于空白組，且相比較有顯著性差異(P<0.05)(見(jiàn)表1，2，3，4，5，6)。

表6 受試樣品對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

3 討論

現(xiàn)代研究表明，通過(guò)提高宿主免疫功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靈芝具有抗腫瘤作用[1-2]、增強(qiáng)抗病毒效果、且提高氧化酶活性使體內(nèi)自由基清除起到抗衰老作用、降血脂等[3]在醫(yī)學(xué)中起到極其重要的作用。本文以長(zhǎng)白山地區(qū)特有的冷涼氣候條件下栽培的有機(jī)靈芝為原料，探究長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物給予小鼠30d后進(jìn)行觀察，對(duì)小鼠各臟器/體重比值無(wú)差異，說(shuō)明藥物對(duì)小鼠無(wú)影響，在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，小鼠的足跖腫脹度在0.2、0.6g/kg組呈陽(yáng)性，有明顯增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，研究表明上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與給藥劑量有關(guān)；在動(dòng)物給藥期間，各劑量組藥物均明顯高于空白組藥物，說(shuō)明其具有提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞、促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞碳廓清的能力，顯著提高NK細(xì)胞抗瘤活性，說(shuō)明長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物可刺激人單核巨噬細(xì)胞，直接或間接激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，抑制嗜中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡，使細(xì)胞因子有序生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，受試樣品可增強(qiáng)特異性和非特異性細(xì)胞免疫功能，具有提高免疫力功效的作用。根據(jù)《保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法規(guī)范》，長(zhǎng)白山有機(jī)靈芝提取物具有增強(qiáng)免疫力功能的作用。

[1]鄧海林,吳佩穎,王建新. 靈芝的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2005,16(2): 141-143.

[2]林志彬. 靈芝抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版,2002,34(5): 493-498.

[3]You YH,Lin ZB. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species[J]. Acta Pharmacol Sinica,2002,23(9): 787-791.

2017-09-19

*通訊作者：金龍哲(1965-)，男，副研究員，研究方向：農(nóng)特產(chǎn)品加工，E-mail:664130853@qq.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.016

S567.3+1

A