穿心蓮內(nèi)酯高壓液相色譜純化技術(shù)研究

孫寶勝　徐存寬　薛云才　吳本剛

摘要：以穿心蓮提取物為試驗原料，采用動態(tài)軸向壓縮制備色譜技術(shù)進行分離純化，以制備高純度穿心蓮內(nèi)酯。制備柱裝填純化材料：硅膠基質(zhì)C18 10 μm，裝填質(zhì)量300 g，實測柱床規(guī)格50 mm×250 mm。以甲醇水為流動相進行純化工藝優(yōu)化，結(jié)果表明，甲醇水體系下水相添加005 molL乙酸銨能促進穿心蓮內(nèi)酯的溶解，該體系下穿心蓮內(nèi)酯最佳純化工藝條件：流動相55%甲醇水+45% 005 molL乙酸銨緩沖液，流速600 mLmin；檢測波長254 nm，溫度為室溫。

關(guān)鍵詞：穿心蓮內(nèi)酯；分離純化；制備色譜；工藝優(yōu)化

中圖分類號： R2842文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0202-03

收稿日期：2016-05-25

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（編號：20150500）；江蘇大學(xué)高級人才科研啟動基金（編號：15JDG070）。

作者簡介：孫寶勝（1983—），男，山東菏澤人，碩士，助理工程師，主要從事藥食同源植物活性成分提取分離技術(shù)以及功能活性評價研究。Tel：（0523）86086656；E-mail：s_baosheng@163com。

通信作者：吳本剛，博士研究生，講師，主要從事食品功能成分提取及其活性評價研究。Tel：（0511）88795305；E-mail：wubg@ujseducn。

穿心蓮Andrographis paniculata（Burm f） Nees]為爵床科（Acanthaceae）穿心蓮屬（Andrographis Wall ex Nees）植物，別稱一見喜、苦草、四方草、印度草等1]，在中國、印度、馬來西亞等國具有悠久的民間藥用史，在國內(nèi)主要分布在廣東省、廣西壯族自治區(qū)、福建省、四川省等?。▍^(qū)），以廣西壯族自治區(qū)種植面積最大2]。

穿心蓮植株所含穿心蓮內(nèi)酯是目前穿心蓮制劑的主要活性成分3]，其分子式為C20H30O5，在穿心蓮葉中含量高達(dá) 184%。現(xiàn)代藥理研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有抗炎抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、治療心腦血管疾病、保肝利膽、抗腫瘤等作用，具有毒性小、價格低的特點。穿心蓮具有清熱解毒、涼血、消腫等功效，在臨床上用于治療呼吸道感染、急性菌痢、腸胃炎等疾病4-5]，還具有防治心血管疾病、抗腫瘤、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)等多重功效6-7]，在我國已作為穿虎寧、穿心蓮注射液等解熱鎮(zhèn)痛藥的原料大量生產(chǎn)8-9]。

穿心蓮內(nèi)酯提取主要采用乙醇直接提取法、水提法、超聲波輔助提取法、酶解輔助提取法等方法，在此基礎(chǔ)上進一步采用大孔樹脂吸附和結(jié)晶等方法進一步純化10]。范云鴿等采用ADS-7樹脂對傳統(tǒng)的乙醇回流提取液進行純化，分離干燥后得到的浸膏中穿心蓮內(nèi)酯含量達(dá)253%11]。本試驗原料為穿心蓮經(jīng)乙醇水提取、大孔樹脂純化后粗品，在此基礎(chǔ)上采用反相高壓液相色譜對其進一步純化，優(yōu)化工藝條件以獲得高純度的產(chǎn)品，旨在為穿心蓮內(nèi)酯的精制提供工藝參考。

1材料與方法

11試劑

甲醇（AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；娃哈哈牌飲用純凈水，自制去離子水；乙酸銨（AR），國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；9958%穿心蓮內(nèi)酯對照品，46%穿心蓮內(nèi)酯乙醇水粗提物。

12儀器及設(shè)備

Waters 2695—2998高效液相色譜儀；Waters Sunfire C18 5 μm 46 mm×250 mm色譜柱，柱恒溫箱；創(chuàng)新牌制備型50DAC液相色譜儀；裝填普通C18填料色譜柱300 g，實測柱床高度250 mm，柱床直徑50 mm；萬分之一分析天平（賽多利斯公司）；超聲波清洗機。

13試驗方法

131標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線測試液相方法：Waters 2695—2998高效液相色譜儀，Sunfire C18 46 mm×250 mm柱，流動相甲醇 ∶水=55 ∶45，水相中含有01%乙酸，進樣體積5 μL，柱溫度25 ℃，流速1 mLmin，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)和峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確稱取0010 0 g純度9958%對照品，用甲醇定容至50 mL，超聲混勻，配制020 mgmL標(biāo)準(zhǔn)液，依次稀釋得到 020、010、006、004、002 mgmL梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，進Waters液相測試，鑒于該物質(zhì)溶解度較低，故采取增大進樣體積方式增大進樣量，分別進樣10 μL和15 μL作為 04 mgmL 和06 mgmL濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線點。

132甲醇水流動相體系下保留時間優(yōu)化

為考察穿心蓮內(nèi)酯在該C18柱甲醇水體系下的保留性能，用穿心蓮對照品做試驗樣品考察合適該物質(zhì)的甲醇比例。試驗初始條件：流速600 mLmin，定量環(huán)進樣300 μL，波長254 nm，溫度為室溫。

穿心蓮內(nèi)酯溶解較差，相對其他有機試劑，其在甲醇、乙醇中溶解性相對較好。從可行性和經(jīng)濟方面考慮，本試驗有機相優(yōu)先考慮甲醇。因該部分試驗主要考察穿心蓮內(nèi)酯保留時間，故試驗樣品采用對照品，可以有效節(jié)約色譜系統(tǒng)凈化時間和保護色譜系統(tǒng)。

根據(jù)文獻(xiàn)資料和該物質(zhì)理化性質(zhì)，選用70%、60%、52%、50%甲醇水流動相比例進行試驗?？疾齑┬纳弮?nèi)酯在試驗條件下的保留時間參數(shù)，得出在該純化填料下較為合理的保留時間。

133穿心蓮內(nèi)酯溶解量優(yōu)化

由前期試驗可知，制備時甲醇比例50%～60%為宜，該條件下穿心蓮內(nèi)酯保留時間在 12～28 min。色譜純化過程工藝中，樣品的溶解性決定制備效率，因而有必要對穿心蓮內(nèi)酯的溶解性進一步優(yōu)化。本試驗中，樣品采用50%甲醇水溶解，在水相中加入005 molL乙酸銨改變?nèi)芤豪砘再|(zhì)，以期增大其溶解度。endprint

配制50%甲醇、50%乙酸銨水溶液，取7支規(guī)格50 mL離心管，標(biāo)號0、1、2、3、4、5、6，0號加入20 mL 50%甲醇水和 400 mg 原料藥，1～6號分別加入50%乙酸銨水混合溶液 20 mL，依次加入46%粗品原料100、200、300、400、600、1 200 mg，充分搖勻并超聲促溶3 min，取出密閉靜置過夜。次日以8 400 rmin離心10 min，取上清液，過 022 μm 有機濾膜，分別上Waters液相測試，每組做3個平行，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶解度。

134制備優(yōu)化試驗

以純度46%穿心蓮為原料，以甲醇+乙酸銨水溶液（005 molL）為流動相，根據(jù)雜質(zhì)分離情況對流動相甲醇比例進行適當(dāng)再優(yōu)化。

46%粗品溶解液：根據(jù)“133”節(jié)試驗結(jié)果，采用最大溶解方式溶解，過045 μm濾膜過濾備用。

2結(jié)果與分析

21標(biāo)準(zhǔn)曲線

以穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)濃度條件下色譜峰面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由圖1可知，穿心蓮內(nèi)酯在002～060 mgmL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2為0999 9。

22流動相中有機相甲醇比例優(yōu)化

根據(jù)已知文獻(xiàn)以及穿心蓮內(nèi)酯在C18柱上的保留性質(zhì)，在優(yōu)化流動相時，優(yōu)先使用70%甲醇水流動相作為洗脫條件。

由圖2可知，70%甲醇水條件下保留時間為83 min，保留時間較短，若作為粗品的純化方法則易出現(xiàn)目標(biāo)物與雜質(zhì)分離度小的情況，故有必要進一步降低甲醇比例，增大保留時間。60%、52%、50%甲醇流動相條件下的色譜分別如圖3、圖4、圖5所示。

分析色譜圖（圖3至圖6）可知，60%、52%、50%甲醇流動相條件下，穿心蓮內(nèi)酯的保留時間分別為1303、2300、2760 min。由此可知，甲醇比例在50%～60%時，穿心蓮內(nèi)酯保留時間為 12～28 min，保留時間適中。該甲醇比例條件下，制備周期較短且有可能獲得較好的分離度。綜合分析各條件下穿心蓮內(nèi)酯保留時間，暫將52%甲醇水流動相作為進一步優(yōu)化的基礎(chǔ)條件，并在此基礎(chǔ)上進行后續(xù)試驗。

23穿心蓮內(nèi)酯溶解量試驗

根據(jù)“133”節(jié)溶解量試驗方案，得出各物料比條件下穿心蓮內(nèi)酯的濃度。由表1可知，20 mL混合溶液加入 600 mg 原料時，穿心蓮內(nèi)酯溶解度達(dá)416 mgmL。

以50%甲醇、50%乙酸銨水溶液為溶劑，加入1200 g 46%的原料藥和20 mL溶劑，常溫下得到530 mgmL穿心蓮內(nèi)酯溶液。乙酸銨、甲醇水溶液溶解樣品后得到澄清色液體，甲醇水溶液條件下得到的溶液渾濁，呈現(xiàn)青黃色且透光度較差，說明在甲醇水溶液基礎(chǔ)上，加入乙酸銨能有效提高物質(zhì)的溶解性。

24制備條件下甲醇乙酸銨水優(yōu)化試驗

根據(jù)“22”節(jié)試驗，初步確立52%甲醇水基礎(chǔ)流動相；由“23”節(jié)試驗結(jié)果可知，在甲醇水乙酸銨體系下，穿心蓮內(nèi)酯粗溶解濃度較好。以該溶液作為色譜制備工藝進樣原料，在此流動相和溶解量基礎(chǔ)上進一步對工藝進行優(yōu)化。

“22”節(jié)試驗已經(jīng)研究了甲醇比例對穿心蓮內(nèi)酯溶解度的影響，因而本次試驗只在原來基礎(chǔ)上進行細(xì)微優(yōu)化。首先考察52%甲醇水乙酸銨體系下穿心蓮內(nèi)酯粗品分析圖譜，進樣體積和檢測波長等參數(shù)不變。

由圖6分析可知，穿心蓮內(nèi)酯保留時間2250 min，但目標(biāo)峰后存在一明顯雜質(zhì)峰且分離度較差，不利于制備分離純化。

前期試驗結(jié)果表明，提高流動相中甲醇的比例，穿心蓮內(nèi)酯保留時間變短。由圖6可知，目標(biāo)物質(zhì)峰和前雜質(zhì)峰分離度較好，因此將流動相中甲醇比例提高到55%，乙酸銨水溶液比例為45%，其他條件不變，進樣分析。

由圖7可知，該制備條件下主峰與雜質(zhì)峰分離效果較好，雜質(zhì)峰4和峰6與目標(biāo)物質(zhì)分離度大，且目標(biāo)峰保留時間為175 min，故該流動相條件下目標(biāo)物質(zhì)有效分離且縮短了制備時間。

25制備工藝放大試驗

使用“23”節(jié)中6號溶解液，穿心蓮內(nèi)酯含量約為 530 mgmL；流動相：55%甲醇、45% 005 molL乙酸銨緩沖液；模擬制備色譜柱：某公司C18 10 μm 46 mm×250 mm。穿心蓮內(nèi)酯溶解量不高，故放大試驗采取增大上樣體積的方式。進樣120 mL，得制備色譜如圖8所示。

收集穿心蓮整峰，進樣測定，按峰面積歸一化法計算，穿心蓮內(nèi)酯含量9990%，因收集整個主峰，故而回收率接近100%。

當(dāng)進樣120 mL時，制備回收率和目標(biāo)物質(zhì)純度均較高，為提高制備效率，需進一步增大上樣體積，以提高上樣量。其他參數(shù)不變條件下進樣1200 mL，得圖9所示色譜圖。

如圖9所示，制備時按下述方法收集：收集峰1峰起至后峰肩餾分并標(biāo)號為F1；收集峰1后峰肩至峰尾餾分并標(biāo)號為F2。

按峰面積歸一化法計，餾分F1穿心蓮內(nèi)酯含量為 9927%，有效回收率占8600%（圖10）。F2餾分內(nèi)酯含量為8900%，后雜質(zhì)含量為1084%，根據(jù)峰面積粗略計算，該段餾分中穿心蓮內(nèi)酯占總內(nèi)酯的2%。

3結(jié)論

穿心蓮內(nèi)酯在002～060 mgmL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0999，可用于穿心蓮內(nèi)酯定量分析。

經(jīng)甲醇乙酸銨水體系優(yōu)化，穿心蓮內(nèi)酯溶解度有效提高，溶解量達(dá)到530 mgmL。

常溫制備條件下，純穿心蓮內(nèi)酯上樣體積1200 mL，上樣量為6360 mg，上樣量占柱填料質(zhì)量百分比約為02%。餾分中穿心蓮內(nèi)酯純度9927%，回收率為8600%。

參考文獻(xiàn)：

1]ZK（#]靳鑫，時圣明，張東方，等 穿心蓮化學(xué)成分的研究J] 中草藥，2012，43（1）：47-50

2]邵艷華 穿心蓮種質(zhì)資源及其質(zhì)量評價研究D] 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015

3]李志亨，路新華，龍曉英，等 穿心蓮內(nèi)酯的研究進展J] 時珍國醫(yī)國藥，2012（11）：2854-2857

4]管晨，李敏，任慶杰，等 穿心蓮內(nèi)酯通過抗炎和調(diào)節(jié)免疫提高EV71感染小鼠的生存率J] 免疫學(xué)雜志，2013，29（9）：737-744

5]程慧娟，劉江，張庚 穿心蓮內(nèi)酯抗銅綠假單胞菌生物被膜及與阿奇霉素協(xié)同抗菌作用J] 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24（2）：120-123

6]Sheeja K，Guruvayoorappan C，Kuttan G Antiangiogenic activity of Andrographis paniculata extract and andrographolideJ] International Immunopharmacology，2007，7（2）：211-221

7]Chao W W，Kuo Y H，Lin B F Anti-inflammatory activity of new compounds from Andrographis paniculata by NF-kappaB transactivation inhibitionJ] Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（4）：2505-2512

8]李曙光，葉再元 穿心蓮內(nèi)酯的藥理活性作用J] 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（5）：984-986

9]王艷輝，王伽伯，郝慶秀，等 不同產(chǎn)地穿心蓮的含量測定，化學(xué)指紋圖譜及抑菌活性評價J] 中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（9）：77-82

10]ZK（#]徐靚 穿心蓮內(nèi)酯的提取及純化工藝研究D] 成都：成都理工大學(xué)，2007

11]范云鴿，張秀莉，史作清，等 大孔吸附樹脂提取穿心蓮總內(nèi)酯的研究J] 離子交換與吸附，2002，18（1）：30-35endprint