家蠶抗菌肽基因BmMoricin的克隆及重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

謝昆　麗仙　王靖　朱靈明　尹建華　葉青霞　孫艷

摘要：抗菌肽是構(gòu)成昆蟲體液免疫的主要方式，BmMoricin是家蠶免疫系統(tǒng)中1種重要的抗菌肽，具有極強(qiáng)的抑菌活性。以家蠶中腸組織總RNA為模板，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增BmMoricin，構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BmMoricin重組蛋白。結(jié)果表明，BmMoricin基因片段的大小為201 bp，編碼66個(gè)氨基酸，自誘導(dǎo)表達(dá)的BmMoricin重組蛋白大小約為19 ku，表達(dá)產(chǎn)率比異丙基-β-D-疏基半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率高，為BmMoricin抗菌肽的生物學(xué)活性鑒定及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：家蠶；抗菌肽；BmMoricin；重組蛋白；自誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)： Q785；S8812+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0052-03[

收稿日期：2016-06-30

基金項(xiàng)目：云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：DCXM163018）；紅河學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：SZ1520）；紅河學(xué)院應(yīng)用型科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：XJY15Z07）；紅河學(xué)院博士專項(xiàng)（編號(hào)：XJ15B13）。

作者簡(jiǎn)介：謝昆（1975—），男，云南昆明人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：xk_biology2@126com。

在昆蟲細(xì)胞中，天然免疫是主要的免疫屏障，抗菌肽在阻止微生物入侵和預(yù)防感染方面具有重要的作用，抗菌肽具有分子量低、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、抗菌性廣譜、抑菌活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]，絕大部分的抗菌肽由復(fù)雜的基因家族編碼，因此大量的抗菌肽是宿主抵抗微生物感染的主要方式[2-3]。在細(xì)胞內(nèi)抗菌肽的誘導(dǎo)表達(dá)受Toll和IMD信號(hào)途徑的調(diào)控[4]，然而，抗菌肽的生物學(xué)功能也各有差異，抗菌肽Cecropins和Moricin具有極強(qiáng)的抗革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌活性，但抗真菌活性較弱，而Drosomycin具有極強(qiáng)的抗真菌活性，不同的抗菌肽家族成員之間抗菌機(jī)理也不同[5-6]。在家蠶細(xì)胞中，家蠶抗菌肽BmMoricin最先是從家蠶血淋巴中分離得到，主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有抑菌活性，BmMoricin包含61個(gè)氨基酸殘基，前22個(gè)形成預(yù)測(cè)的分泌肽，成熟的BmMoricin含39個(gè)氨基酸，通過(guò)其氨基端α-螺旋插入到細(xì)菌質(zhì)膜，增加細(xì)菌的滲透壓來(lái)抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，在BmMoricin[CM（215]家族的12個(gè)基因成員中，含8個(gè)B亞家族（BmMoricin B1～B8）、3個(gè)A亞家族（BmMoricin LA1～LA3）、1個(gè)BmMoricin基因，它們?cè)诩倚Q抵抗革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌方面具有極其重要的作用[7]。自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是Studier于2005年發(fā)現(xiàn)的，該系統(tǒng)中含有一定比例的葡萄糖和乳糖，葡萄糖耗盡后乳糖才被利用，目的蛋白開始表達(dá)[8]。自誘導(dǎo)表達(dá)的最終菌體密度大，蛋白產(chǎn)量高，而且沒有毒性，適于重組蛋白的高效表達(dá)[9]。本研究以5齡7 d家蠶中腸組織為材料，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增BmMoricin基因，構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BmMoricin重組蛋白，以期為BmMoricin抗菌肽的抑菌活性研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

家蠶（青松×皓月），由云南省蒙自市家蠶養(yǎng)殖戶提供。質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，均購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；RNAiso Plus，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA鏈接酶、限制性核酸內(nèi)切酶，均購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DL2000 DNA marker、RT-PCR試劑盒、高分子量預(yù)染蛋白marker，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。LB培養(yǎng)基：稱取100 g胰蛋白胨、50 g 酵母抽提物、100 g氯化鈉，加入950 mL蒸餾水中，攪拌直至完全溶解，用10 molL的NaOH調(diào)節(jié)pH值為74，以蒸餾水定容至1 000 mL，105 kPa高壓滅菌20 min；ZYM-5052培養(yǎng)基：精確稱取7098 g Na2HPO4、6804 5 g KH2PO4、11090 5 g NH4Cl、0710 2 g Na2SO4、0240 72 g MgSO4、0222 g CaCl2、0198 g MnCl2、0288 g ZnSO4、0047 g NiCl2、0048 4 g NaMoO4、0012 g H3BO3、5 mL甘油、06 g葡萄糖、2 g 乳糖，加入950 mL蒸餾水中，攪拌直至完全溶解，以蒸餾水定容至1 000 mL，105 kPa高壓滅菌20 min。

12試驗(yàn)方法

121引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的BmMoricin（AB0069151）mRNA序列，應(yīng)用Primer Primer 50引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物為F：5′-CATG[ZZ（Z]CCATGG[ZZ）]CAAAAAT [JP2]ACCTATCAAGGCCATTAAGACTGTAGGAAAGGCAGTCGGTA-3′，R：5′-CCG[ZZ（Z]CTCGAG[ZZ）]TCAATGCTTTCTTTTCTTCGGTTTCA AGAAATTGAAAACATC-3′，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

122總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增

取5齡7 d家蠶的中腸組織，應(yīng)用RNAiso Plus提取其總RNA，提取方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[10]。應(yīng)用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScriptTM One Step RT-PCR試劑盒，RT-PCR擴(kuò)增出BmMoricin抗菌肽基因，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。endprint

123表達(dá)載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切BmMoricin基因和pET32a載體，構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定、PCR鑒定等操作方法均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[10]。

124重組蛋白的異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)

構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度為01 mmolL的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，分別收集誘導(dǎo)0～6 h的菌液，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。

125重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

按照Studier的方法進(jìn)行自誘導(dǎo)表達(dá)研究[8]。挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落，接種到4 mL含有100 μgmL氨芐青霉素（Amp）的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 、220 rmin培養(yǎng)過(guò)夜，再按1%的接種量接種到10 mL含有100 μgmL Amp的ZYM-5052培養(yǎng)基中，37 ℃、220 rmin培養(yǎng)12、14、16、18、20、22 h后收集菌液，與IPTG誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析，比較兩者重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率的差異。

2結(jié)果與分析

21家蠶抗菌肽基因的RT-PCR擴(kuò)增

以5齡7 d時(shí)期家蠶的中腸組織總RNA為模板，通過(guò) RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增家蠶抗菌肽基因BmMoricin。由圖1可知，目的基因片段的大小約為201 bp，可以編碼66個(gè)氨基酸，與預(yù)期結(jié)果一致。

[FK（W15][TPXK1tif]

22表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建pET32a-BmMoricin原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，PCR和NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定結(jié)果如圖2、圖3所示。從圖2可以看出，經(jīng)PCR鑒定重組質(zhì)粒的大小與圖1中RT-PCR的結(jié)果一致；從圖3的重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果可以看出，大片段為pET32a載體片段，小片段為酶切后的BmMoricin小片段。

23抗菌肽重組蛋白的自誘導(dǎo)表達(dá)

抗菌肽分別經(jīng)1 mmolL IPTG誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5、6 h和自誘導(dǎo)表達(dá)12、14、16、18、20、22 h后，由圖4可知，IPTG和自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)皆能成功表達(dá)BmMoricin重組蛋白（箭頭所指），表達(dá)的重組蛋白大小為19 ku，自誘導(dǎo)系統(tǒng)組表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)率明顯高于IPTG誘導(dǎo)組。

3討論

昆蟲是一類進(jìn)化上較為低等的動(dòng)物，同時(shí)也是世界上種類和數(shù)量最多的動(dòng)物。面對(duì)大量的外源微生物的侵害，雖然沒有類似于哺乳動(dòng)物的特異性免疫系統(tǒng)， 但是仍然能夠較好地生存，說(shuō)明昆蟲必定有對(duì)非特異因子產(chǎn)生免疫應(yīng)答的高效先天免疫系統(tǒng)，昆蟲的免疫系統(tǒng)由體液免疫和細(xì)胞免疫組成[11]。昆蟲的體液免疫與高等動(dòng)物有明顯的差異，主要依賴血液中的抗菌肽和蛋白質(zhì)。當(dāng)昆蟲機(jī)體受到病原微生物侵染時(shí)，體內(nèi)的識(shí)別蛋白能夠識(shí)別微生物表面的肽聚糖或脂多糖及其他物質(zhì)，引發(fā)絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細(xì)胞外級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終在其脂肪體、血液、中腸和表皮等器官或組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽，進(jìn)而殺滅外源微生物[12]。2006年Cheng等通過(guò)對(duì)家蠶基因組框架圖序列的搜尋，找到了35條抗菌肽基因序列[2]。Moricin是由Hara等首先從家蠶血淋巴中分離得到的，對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌均有強(qiáng)烈的抗菌活性，家蠶抗菌肽moricin（BmMoricin）由61個(gè)氨基酸殘基組成，在其N-末端部分每隔3～4個(gè)氨基酸殘基就有帶電荷氨基酸，只形成1個(gè)長(zhǎng)的具有親水脂性質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)，在C-末端則存在堿性氨基酸殘基串，沒有發(fā)現(xiàn)BmMoricin有氨基酸的修飾，其抗菌機(jī)制可能是利用堿性C端與細(xì)胞膜表面作用，然后利用N端改變膜的通透性，形成離子通道[13]。BmMoricin的等電點(diǎn)高達(dá)120，對(duì)細(xì)菌的抗性明顯高于BmCecropin家族各成員[13]。

本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)從5齡7 d家蠶中腸組織中克隆BmMoricin抗菌肽基因，構(gòu)建pET32a-BmMoricin重組表達(dá)載體，采用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中對(duì)重組蛋白進(jìn)行自誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，自誘導(dǎo)系統(tǒng)組的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)率明顯高于IPTG誘導(dǎo)組。試驗(yàn)結(jié)果為家蠶抗菌肽的純化、活性鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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