蘿卜花序軸再生體系的建立

婁麗娜　戴澈　劉根新　喬俊楠　季延娣　蘇小俊

摘要：以蘿卜雄性不育系的幼嫩花序軸為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，可成功誘導(dǎo)出苗。將幼嫩花序軸接種到不同激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，其中在MS+6-BA 30 mgL+NAA 06 mgL培養(yǎng)基培養(yǎng)效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)9231%；用MS+6-BA 10 mgL+NAA 01 mgL培養(yǎng)基誘導(dǎo)成苗，獲得1株再生苗，成苗率為333%；用MS+NAA 10 mgL培養(yǎng)基成功對幼嫩花序軸進(jìn)行生根培養(yǎng)，并被馴化移栽成活。

關(guān)鍵詞：蘿卜；花序軸；組織培養(yǎng)；雄性不育系；激素；外植體；誘導(dǎo)率；成苗率；馴化

中圖分類號： S631104+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0042-02[

收稿日期：2016-09-20

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（編號：BK20130726）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（16）1012]。

作者簡介：婁麗娜（1982—），女，河南濮陽人，博士，副研究員，主要從事蔬菜作物遺傳育種研究。Tel：（025）84391221；E-mail：linabeibei@163com。

通信作者：蘇小俊，博士，研究員，主要從事蔬菜作物遺傳育種研究。Tel：（025）84391259；E-mail：xiaojunsu@yahoocom。

蘿卜為異花授粉植物，在蘿卜雜交育種中，自交不親和及雄性不育性狀，是雜交制種的2個重要應(yīng)用。研究人員選出的不育系不能立即應(yīng)用于配制雜種，對這樣的材料，采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行保存和繁殖就成為必要手段之一。1980年，祝仲純等成功從蘿卜的下胚軸中誘導(dǎo)植株[1]。隨后，國內(nèi)外學(xué)者采用蘿卜的外植體如帶柄子葉、子葉、下胚軸、帶芽莖段以及頂芽等進(jìn)行培養(yǎng)，均取得了一定的成果[2-8]。

然而，與大多數(shù)植物相比，蘿卜的再生能力較弱，不易通過愈傷組織途徑形成再生植株[9]。在蘿卜中，通常是通過種子萌發(fā)獲得無菌外植體，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，再分化成完整的植株。在實際的生產(chǎn)實踐中，當(dāng)發(fā)現(xiàn)某個材料是雄性不育材料時，往往已經(jīng)是生殖生長期，無法通過種子途徑對材料進(jìn)行保存，也無法通過其營養(yǎng)體階段的頂芽進(jìn)行組織培養(yǎng)保存，根據(jù)吳麗艷等的研究，采用花序軸組培快繁青花菜蘿卜胞質(zhì)雄性不育系，獲得了成功[10]，但在蘿卜上能否成功，鮮見報道。本試驗利用蘿卜雄性不育材料的花序軸為外植體，系統(tǒng)研究其誘導(dǎo)、分化、生根和移栽等步驟，從而建立一套蘿卜花序軸組培快繁的技術(shù)體系，為蘿卜育種材料的保存、繁殖提供參考，為特殊材料的研究和利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供的蘿卜雄性不育材料R3-654。

12培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

本試驗所用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基、不定芽分化培養(yǎng)基以及生根培養(yǎng)基都是在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加植物激素組成的，具體配比如表1所示。培養(yǎng)基的蔗糖濃度均是 20 gL，并添加瓊脂07%，pH值為58。接種后置于 25 ℃ 下，光照度為2 500 lx，光照時間為12 hd。

13試驗方法

131外植體消毒處理

從供試材料植株上取幼嫩花序軸，用洗滌劑洗滌后，自來水流動沖洗30 min，用70%乙醇浸泡40 s，再放入10%次氯酸鈉中消毒5～10 min，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3～4次，最后一次浸泡3～5 min，用無菌濾紙吸干表面水分，將花序軸切成05～10 cm的小段待用[11]。

132誘導(dǎo)培養(yǎng)

經(jīng)處理后的花序軸小段分別接種到（1）、（2）、（3）、（4）、（5）號培養(yǎng)基上，10 d后觀察愈傷組織情況，計算愈傷組織誘導(dǎo)率（%）。

133分化培養(yǎng)

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到（6）、（7）、（8）、（9）號增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計出苗數(shù)，計算成苗率（%）。

134組培苗的生根和移栽

[JP2]通過繼代增殖形成的無根苗長成3～4 cm高并帶有2～3張幼葉時，轉(zhuǎn)入（10）號生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)生根[5]。20～25 d后，將試管苗的瓶蓋打開放到溫室內(nèi)過渡2～3 d，取出試管苗，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，栽入到已滅菌的營養(yǎng)土中，放入拱棚后在上面覆蓋塑料膜和遮陽網(wǎng)，每天揭膜若干小時，保持一定的溫度（20～28 ℃）和濕度（85%～90%），10 d后移栽到大田，20 d后考察成活情況。

2結(jié)果與分析

21不同激素配比培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)效果

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后發(fā)現(xiàn)，在（1）、（2）、（3）、（4）號誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的花序軸小段的切口部位逐漸膨大，并產(chǎn)生淡綠色的愈傷組織。由圖1-A、圖1-B可知，（1）、（2）號培養(yǎng)基中的愈傷組織與其他組織相比，愈傷組織較大且較多的外植體都產(chǎn)生了淡綠色的愈傷組織。誘導(dǎo)培養(yǎng)基（3）誘導(dǎo)效果較差，只有少數(shù)的外植體膨大，多數(shù)外植體發(fā)生了褐變和白化現(xiàn)象（圖1-C）；（4）號培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果一般，只有部分外植體膨大，產(chǎn)生綠色愈傷組織，部分外植體也出現(xiàn)了褐變現(xiàn)象（圖1-D）；作為對照的（5）號誘導(dǎo)培養(yǎng)基，未添加激素，其外植體膨大較少，零星幾個膨大，且愈傷組織較?。▓D1-E）。

不同激素配比對愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。由表2可知，（1）、（2）號培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率較高，分別為9000%、9231%；其次為（4）號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為4545%；（3）號誘導(dǎo)培養(yǎng)基較差，誘導(dǎo)率僅為1667%；作為對照的（5）號培養(yǎng)基最差，誘導(dǎo)率僅為727%。

22不同激素配比培養(yǎng)基對成苗的誘導(dǎo)效果及生根培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的愈傷組織分別接種到（6）、（7）、（8）、（9）號培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，7 d后（7）號培養(yǎng)基上即開始出現(xiàn)綠色的芽點，并逐漸分化成小芽，逐漸發(fā)育為小植株（圖2-A）。有的在愈傷組織上，開始有綠色的組織生成，但直到30 d后，也未誘導(dǎo)成芽，進(jìn)而也未發(fā)育成苗（圖2-B）。endprint

采用（10）號生根培養(yǎng)基對獲得的無根苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)，產(chǎn)生了十幾條根，較粗壯且平整（圖2-C）。證明武劍等采用的蘿卜生根方法，可以有效地應(yīng)用在本試驗中[5]。經(jīng)過馴化和移栽，最終成功獲得R3-654的再生植株。

由表3可看出，最終只在（7）號培養(yǎng)基上，獲得1個植株，成苗率為333%。

3討論

在誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基上，（1）、（2）號培養(yǎng)基的6-BA的濃度均為 30 mgL，而濃度為06 mgL NAA比濃度為04 mgL的誘導(dǎo)率稍高，但二者的誘導(dǎo)率相差不大，且誘導(dǎo)效果較好；對比（3）、（4）號培養(yǎng)基，6-BA濃度相同，均為40 mgL，NAA的濃度分別為04、06 mgL，但誘導(dǎo)率較（1）、（2）號培養(yǎng)基低，同樣NAA的濃度為 06 mgL 比 04 mgL 的誘導(dǎo)率稍高。說明6-BA濃度為 30 mgL，NAA濃度為06 mgL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，誘導(dǎo)率高達(dá)9231%。

設(shè)置4個分化培養(yǎng)基，但只在（7）號培養(yǎng)基上獲得1株再生苗，說明蘿卜的再生能力較弱，不易通過愈傷組織途徑形成再生植株，這與熊秋芳等的結(jié)論[9]一致。本試驗的誘導(dǎo)成苗率太低，須要對分化培養(yǎng)基的激素種類和配比進(jìn)行進(jìn)一步的探索，同時在試驗中要降低污染率、提高成苗效率。

采用了武劍等的方法[5]對再生植株進(jìn)行生根、馴化及移栽，獲得蘿卜R3-654的再生植株，證明MS+NAA 10 mgL 對蘿卜無根苗的生根的效果很好，在苗數(shù)較少的情況下，可以保證再生苗的成活率。

本研究結(jié)果表明，雖然蘿卜的再生能力較弱，通過愈傷組織途徑形成再生植株較困難，但采用花序軸作為外植體對蘿卜雄性不育株進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織，再生植株的方法是可行的。如果后續(xù)研究能提高愈傷組織再生苗的成活率，那么該方法就[CM（25]可被廣泛應(yīng)用于蘿卜雄性不育系的種質(zhì)保存和雜交育種

中，具有很好的理論研究和實際應(yīng)用價值。

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