撒瓦那柏芽誘導(dǎo)增殖試驗(yàn)

周余華　金文浩　鄒迎子

摘要：以撒瓦那柏1年生莖尖作為外植體，研究氯化汞對(duì)外植體的影響，并篩選合適的初代和繼代培養(yǎng)激素添加。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)撒瓦那柏莖尖用01%氯化汞處理7～8 min滅菌效果最好，用MS作為初代培養(yǎng)基，添加1 mgL 6-BA 誘導(dǎo)率達(dá)60%，添加005 mgLNAA誘導(dǎo)率達(dá)80%；以MS+6-BA 05 mgL+NAA 005 mgL為繼代培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)795%。

關(guān)鍵詞：撒瓦那柏；滅菌；芽誘導(dǎo)；增殖培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： S68704+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0039-03[

收稿日期：2016-06-02

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院鄉(xiāng)土樹種種質(zhì)資源創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2013td04）。

作者簡(jiǎn)介：周余華（1964—），男，江蘇泰興人，博士，副教授，主要從事園林植物生理生態(tài)研究及教學(xué)生產(chǎn)。E-mail：uua16hot@126com。

撒瓦那柏（Chamaecyparis pisifera cv aurea）別稱金色海岸線、金葉日本花柏、金葉撒瓦那扁柏，為柏科扁柏屬植物，屬于常綠彩化針葉樹中的黃化品種。樹皮呈薄片紅褐色。鱗葉緊貼，小枝下垂，細(xì)長(zhǎng)。3月開花，雌球花單生枝頂，雄球花橢圓形，雌雄同株，球果11月成熟，種子有棱角微扁卵圓形，種鱗盾形木質(zhì)。溫帶及亞熱帶樹種，性喜溫暖濕潤(rùn)氣候，喜光，抗寒耐旱耐半陰，喜深厚沙壤土，能適應(yīng)平原環(huán)境。幼苗期每年的生長(zhǎng)量較小，到郁閉后才會(huì)進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)階段，耐修剪。生長(zhǎng)高度和蓬徑均可達(dá)12 m。原產(chǎn)日本，我國(guó)北京、南京、青島、廬山、上海、杭州等地均有栽培，上海市綠化管理局推薦的新優(yōu)植物品種名錄中就有該種植物[1]。撒瓦納柏姿態(tài)婆娑，枝黃纖弱，觀賞價(jià)值良好，可用于多種場(chǎng)合，如在園林中可叢植、群植、孤植于供庭園、門邊、屋隅；花園里可以將其布置成小土丘狀，新葉呈現(xiàn)明亮金黃色，垂下的枝條好似一個(gè)小瀑布姿態(tài)優(yōu)雅，盡顯品味，可以給人帶來(lái)愜意舒暢的感覺。因此，撒瓦納柏是園林中色塊運(yùn)用、模紋鑲拼、彩籬構(gòu)建的絕佳材料，是稀少的色彩穩(wěn)定的柏科植物[2-3]。然而，由于其繁殖速度緩慢，市場(chǎng)上還沒(méi)有銷售。

撒瓦那柏可以進(jìn)行播種、扦插和壓條繁殖，但是都存在一定的不足，因此通過(guò)組織培養(yǎng)加快撒瓦納柏的繁殖速度就成為一條很重要的快繁捷徑。本研究對(duì)撒瓦納柏采用不同的氯化汞消毒時(shí)間，啟動(dòng)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基和激素添加，確立最佳氯化汞消毒時(shí)間、最佳培養(yǎng)基及激素配比濃度，為撒瓦那柏組織培養(yǎng)的進(jìn)一步研究奠定良好基礎(chǔ)，為撒瓦那柏規(guī)模化生產(chǎn)和工廠化育苗提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所采用的材料來(lái)自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院苗圃，在連續(xù)放晴4 d后于2015年3月7日采集撒瓦那柏健壯1年生莖段的無(wú)病蟲害外植體。

12試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

121外植體的整理

摘取撒瓦那柏1年生枝條的莖尖，剪切成長(zhǎng)約25 cm的莖段，放入白瓷缸中用加了少量洗衣粉的水搓洗2 min，將泡沫淘洗干凈后于自來(lái)水下流水沖洗12 h，待進(jìn)行消毒處理試驗(yàn)。

122消毒處理

先用75%乙醇處理30 s，再用01%氯化汞（HgCl2）進(jìn)行消毒處理，時(shí)間分別設(shè)置為4、5、6、7、8、9 min 6個(gè)處理，最后用無(wú)菌水沖洗4次，殘留的水分用無(wú)菌濾紙吸取。將消毒完畢的莖尖置于無(wú)菌紙上，用剪刀、鑷子剪去莖尖的下端02 cm，以免影響其從培養(yǎng)基中吸收養(yǎng)分，接種于MS[HJ14mm]培養(yǎng)基上，每處理接種20瓶，每個(gè)試管型組培瓶放1個(gè)外植體。培養(yǎng)基為MS+30 gL蔗糖+7 gL瓊脂。每隔1 d觀察1次外植體的污染情況，8 d后對(duì)外植體的死亡率、污染率和成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

13啟動(dòng)培養(yǎng)

篩選不同的培養(yǎng)基MS、12MS、WPM，選用不同的6-BA[HJ]和NAA的濃度：6-BA濃度分別為05、10、15 mgL，NAA的濃度分別是005、010、020 mgL，共計(jì)18種處理，每種處理20瓶，每試管瓶置1個(gè)外植體（表1）。研究不同激素不同濃度下外植體萌芽情況。萌發(fā)率=萌發(fā)數(shù)接種數(shù)×100%。

14繼代增殖培養(yǎng)技術(shù)研究

將啟動(dòng)培養(yǎng)中的撒瓦納柏莖段枯黃部分剪去，將誘導(dǎo)的芽體接入6-BA和NAA混合激素的MS培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其產(chǎn)生叢生芽并使其擴(kuò)繁。繼代增殖培養(yǎng)采用3種激素濃度的方法進(jìn)行梯度試驗(yàn)，共計(jì)9種處理，每種處理20瓶，培養(yǎng)基 20 mL瓶（表2）。誘導(dǎo)率=新芽發(fā)生數(shù)接種數(shù)×100%（接種30 d后統(tǒng)計(jì)成苗數(shù)）。

15培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基內(nèi)均添加7 gL瓊脂和30 gL蔗糖，調(diào)節(jié)pH值為58～60，在121 ℃高壓下滅菌25 min。將接種后的植物體置于培養(yǎng)室內(nèi)，光照16 hd，光照度約為2 000 lx，溫度控制在（25±2） ℃。

2結(jié)果與分析

21不同消毒時(shí)間對(duì)撒瓦那柏莖尖污染的影響

不同氯化汞消毒時(shí)間對(duì)撒瓦那柏莖尖污染率、死亡率有明顯影響（表3）。對(duì)外植體處理效果最好的是處理4和處理5，成活率達(dá)到570%和572%，污染率最高的也是處理1，達(dá) 525%，而死亡率最高的是處理6，達(dá)412%，毫無(wú)疑問(wèn)死亡率隨氯化汞處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，污染率反而下降，這表明隨著氯化汞處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)外植體的傷害也就越大，使植物的細(xì)胞失去活力。從表3中各項(xiàng)指標(biāo)綜合起來(lái)可以看出，處理4和處理5是最好的處理?xiàng)l件，也就是在75%的乙醇處理30 s后，用01%氯化汞處理7～8 min外植體的成活率最大。

啟動(dòng)培養(yǎng)中污染多為真菌污染和細(xì)菌污染。其中細(xì)菌污染占25%，其菌落較小，嗅一下有臭味，表面呈乳脂狀光澤。真菌污染占172%，其菌落大，顏色多樣，多為黃、白、灰、黑等顏色，表面呈毛絨狀，嗅之一般有霉味。造成污染的來(lái)源有很多，有外植體、培養(yǎng)基pH值、激素濃度、操作人員的不恰當(dāng)操作、培養(yǎng)瓶、接種工具等多方面因素。endprint