高效液相色譜-三重四級桿質譜分析血樣中托吡酯及代謝物

(1.湖北省黃岡市羅田縣九資河鎮(zhèn)衛(wèi)生院,黃岡 438636；2.鹽城市第三人民醫(yī)院,鹽城 224005；3.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院,鹽城 224005)

高效液相色譜-三重四級桿質譜分析血樣中托吡酯及代謝物

張朝輝1季宏建2鞏克民3*

(1.湖北省黃岡市羅田縣九資河鎮(zhèn)衛(wèi)生院,黃岡 438636；2.鹽城市第三人民醫(yī)院,鹽城 224005；3.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院,鹽城 224005)

采用高效液相色譜-三重四級桿質譜(HPLC-MS/MS)，對血樣中托吡酯及主要代謝物2,3-二羥基托吡酯，4,5-二羥基托吡酯進行一級質譜和二級質譜分析檢測，首次建立了快速、高效、檢測限更低的多反應質譜檢測(MRM)分析方法，該方法成功應用于服用托吡酯聯(lián)合苯妥英鈉等其他藥物的癲癇患者，同時準確地進行托吡酯及代謝物的血藥濃度監(jiān)測。

液相色譜-三重四級桿質譜 多反應監(jiān)測 血樣 托吡酯及代謝物

1 前言

托吡酯(TPM)具有廣譜的抗神經興奮和抗驚厥作用，主要用于抗癲癇和偏頭痛的治療，該藥物口服生物利用度高達80%，蛋白結合率僅有13%～17%，消除半衰期達20～30h，托吡酯往往與其他抗癲癇藥物一起服用如：卡馬西平、苯妥英鈉等控制癲癇癥狀，這些藥物可導致托吡酯血藥濃度的降低，因此定量研究托吡酯及其代謝物顯得尤為重要。

對于托吡酯及其代謝物常用的分析檢測方法為高效液相色譜法(HPLC)，但是該方法需要衍生化，存在操作繁瑣，定量下限高的缺點[1]；氣相色譜/質譜(GC/MS)聯(lián)用技術，存在結構容易分解，托吡酯不適合進行GC/MS分析，目前已有一些文獻報導關于LC/MS分析檢測托吡酯的方法但是樣品處理多采用液液萃取的方法[2-4]，存在操作繁瑣的缺陷；本實驗建立了托吡酯及其代謝物的LC/MS/MS多反應監(jiān)測(MRM)分析檢測方法，采用該方法可準確檢測出托吡酯及其代謝物，該方法具有簡單、準確、快速的優(yōu)點。

2 實驗部分

2.1 試劑

甲醇(色譜級，美國Merck公司)；超純水(杭州娃哈哈集團有限公司)；甲酸(色譜級，Agilent公司)；其余試劑均為分析純?？瞻籽獦?購自血站)。

托吡酯對照品(中國食品藥品檢定研究院)， 2,3-二羥基托吡酯對照品，4,5-二羥基托吡酯對照品(Sigma公司)

2.2 儀器及條件

ThermoFinigan TSQ Quantum Discovery Max型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜儀(HPLC配備四元比例閥輸液泵，在線真空脫氣機，自動進樣器及其溫控系統(tǒng)，ESI質譜電離源質譜，Xcalibur高級質譜工作站；十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius)；TGL-16G臺式高速離心機(上海醫(yī)療器械有限公司)。

液相條件：A=超純水，B=甲醇(色譜純)，流動相流速0.5mL/min，梯度為5% B(0～2 min)-20%B(2～2.5min)-25%B(2.5min～4min)-90%B(4min～6min)-5%B(6min～7min)。液相色譜柱Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，3.5μm)，柱溫箱溫度35℃；三重四極桿質譜采用負離子模式，離子源溫度設為300℃，離子源電離電壓為2500V，霧化氣流速為480L/h，離子采集方式采用多反應監(jiān)測模式(MRM)。

2.3 標準溶液的配制

用分析天平分別準確稱取托吡酯、2,3-二羥基托吡酯，4,5-二羥基托吡酯，用超純水配制成濃度為1.0 mg/mL的儲備液，將儲備液用甲醇∶超純水(80∶20)稀釋后使用。

2.4 實驗

對托吡酯、2,3-二羥基托吡酯，4,5-二羥基托吡酯的水溶液進行ESI-全掃描分析，確定目標化合物的質譜碎片和保留時間。選擇合適的碎片離子進行子離子掃描，優(yōu)化儀器參數(shù)，確定最優(yōu)的母子關系離子對，建立篩選性高的MRM分析方法。

在空白血樣中加入3個目標化合物，乙腈去蛋白沉淀，取上清液吹干，流動相復融后，按照建立的SRM方法進行分析檢測。

對健康人血樣乙腈去蛋白沉淀，濃縮后按照MRM方法進行托吡酯及代謝物的篩查分析。

3 結果與討論

3.1 LC-ESI--MS結果

對TPM、4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM標準樣品的水溶液進行ESI-全掃描分析，這些化合物的質譜圖如圖1所示，各化合物均檢測到較強的[M-H]-碎片離子；另外，4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM還檢測到[M+Cl]-離子。采用該方法獲得TPM、4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM的最低檢測限分別為：0.1、0.01和0.001mg·L-1。采用全掃描分析3個目標化合物的檢測限較高，適合進行常量分析檢測，不適于痕量目標化合物的檢測。

從圖1可以看出，TPM、4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM的主要碎片離子分別為m/z: 95.9和77.9，其中m/z333.6 碎片離子信號較弱。因此，分別選擇m/z:178.1、和224.1碎片離子進行二級質譜研究。

3.2 LC-ESI-MS/MS結果

依據一級質譜分析獲得的結果，分別選擇TPM、4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM的本底干擾較小的碎片離子m/z95.9和77.9進行子離子分析，優(yōu)化碰撞能量，使母離子可見，子離子強度最強，結果見表1。

表1 TPM、4,5-二羥基TPM、2,3-二羥基TPM信息

圖1 目標化合物的色譜和質譜圖(A.TPM、B.4,5-二羥TPM和C.2,3-二羥TPM)

實驗結果表明：對于TPM選擇30V碰撞能量和離子對m/z:338.1→77.9；對于4,5-二羥TPM選擇35V碰撞能量和離子對m/z:298.1→77.9；對于4,5-二羥TPM，選擇35V碰撞能量和離子對m/z: 298.1→77.9；在MRM模式下進行分析檢測TPM、4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM，其定量限分別為：4、0.4和0.04μg·L-1。

目標化合物的質譜裂解解釋為：化合物TPM的[M-H]-特征離子以碳為電荷中心，發(fā)生S-O鍵斷裂同時單氫重排，丟失C6O2H10中性碎片；以不飽和氧為電荷中心，發(fā)生C-O鍵斷裂同時單氫重排，產生結構為[C3O2H6]的碎片離子m/z:77.9；以及[SO3NH2]的碎片離子m/z:95.9；4,5-二羥TPM和2,3-二羥TPM都通發(fā)生C-C鍵斷裂同時單氫重排，丟失C5O3H10中性碎片；以不飽和氧為電荷中心，發(fā)生C-O鍵斷裂同時單氫重排，產生結構為[C3O2H6]的碎片離子m/z:77.9；以及[SO3NH2]的碎片離子m/z:95.9；進一步說明這些碎片離子的碎裂過程是特征的，采用建立的離子對進行3個目標化合物的定性是可靠的。

3.3 血樣中托吡酯以及代謝物濃度的測定

將上述方法用于3位癲癇患者的血藥濃度測定，結果見表2。

表2 3位癲癇患者的血藥濃度監(jiān)測結果

4 結論

本實驗建立的HPLC-MS/MS(SRM)方法測定血樣中的托吡酯和主要代謝物是有效的，檢測限低，滿足醫(yī)學樣品分析需求。

[1] Berry D J, Patsalos P N. Comparison of topiramate concentrationsin plasma and serum by fluorescence polarisation immunoassay[J].Ther Drug Monit,2000,22:460-464.

[2]趙娜,劉雪松,閆冬，等. HPLC-MS-MS 法測定人血漿中托吡酯的濃度[J].中國新藥雜志,2011，20( 12):1108-1111.

[3]劉彬,李艷梅,張君梅，等. 托吡酯膠囊的藥代動力學及生物等效性研究[J].兒科藥學雜志,2014,20 (5):38-41.

[4]Britzi M, Soback S, Isoherranen N, Levy R H, Perucca E, Doose D R, Maryanoff B E, Bialer M. Analysis of topiramate and its metabolites in plasma andurine of healthy subjects and patients with epilepsy by use of a novel liquidchromatography-mass spectrometry assay[J].Ther Drug Monit, 2003,25:314-322.

2017-08-21

張朝輝，男，1971年出生，主管藥師，專科，湖北省黃岡市羅田縣九資河鎮(zhèn)衛(wèi)生院。

鞏克民,男，1979年出生， 碩士，副教授,從事藥物動力學和藥物質量控制研究，江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院， E-mail：gkm110016@163.com。

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ZhangChaohui1，JiHongjian2，GongKemin3

(1.JiuziheHealth-Center,LuotianCountyHuanggangCityHubeiProvince,Huanggang438636,China；2.YanchengThirdPeople’sHospital,Yancheng224005,China;3.JiangsuVocationalCollegeofMedicine,Yancheng224005,China)

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HPLC-MS/MS；MRM，human plasma；topiramate and its main metabolites

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.007