響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡中綠原酸提取分離條件

張嫚，李爽，萬國福，張?zhí)m

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.青島捷安信檢驗(yàn)技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島266071）

響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡中綠原酸提取分離條件

張嫚1，李爽2，萬國福1，張?zhí)m1

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003；2.青島捷安信檢驗(yàn)技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島266071）

以黃牛蒡等外根為原料，通過單因素試驗(yàn)確定以甲醇為提取劑，甲醇濃度、液料比和超聲處理時(shí)間為顯著因素。以上述3個(gè)因素為自變量設(shè)計(jì)了Central Composite Design（CCD）試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明其最佳水平分別為提取劑甲醇濃度50%、牛蒡甲醇料液比1∶100（g/mL）、超聲提取的時(shí)間30min，在此條件下，牛蒡綠原酸的提取量達(dá)3.244mg/g。

牛蒡；綠原酸；超聲提取；響應(yīng)面

近年來，牛蒡在江蘇、山東大量種植推廣[1]。年出口牛蒡在7萬噸以上。但產(chǎn)品多以鹽牛蒡、冷凍什錦蔬菜、速凍牛蒡3種形式出口[2]。目前，中國藥典中將牛蒡列為藥食同源植物[3]，但國內(nèi)牛蒡消費(fèi)量較少，且形態(tài)單一，主要作為蔬菜、茶和中藥出售，商品化程度、附加值和消費(fèi)量都很低。大量的牛蒡等外根價(jià)格低廉，難以售出，不僅降低農(nóng)民的收入，也造成極大的浪費(fèi)[4]。從牛蒡中提取綠原酸、多糖、菊糖、糖蛋白等生理活性成分是牛蒡產(chǎn)品精深加工和產(chǎn)業(yè)增值的重要方向[5-8]。本文對(duì)牛蒡的等外根中的綠原酸提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，并采用高效液相色譜法進(jìn)行了綠原酸含量的檢測(cè)，以期為牛蒡綠原酸的工業(yè)化提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

兩年生新鮮牛蒡等外根：江蘇徐州豐縣。

1.2 試劑

綠原酸標(biāo)品（含量98%）：北京盛世康普化工技術(shù)研究院；其他試劑均為分析純，色譜純，水為蒸餾水。

1.3 儀器

Aglient1200高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；AL204電子天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；GY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；KH-100B型超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.4 牛蒡預(yù)處理工藝流程

新鮮的黃牛蒡等外根洗凈，100℃下滅酶2 min，冷卻，采用0.5%檸檬酸+0.7%VC+1%NaCl護(hù)色，去皮、切片、烘干、粉碎、過60目篩，得牛蒡根干粉，備用[9]。

1.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為327 nm。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1000[10-12]。

1.6 測(cè)定溶液制備

1.6.1 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得（10℃以下保存）。

1.6.2 綠原酸的提取

精密稱取牛蒡粉1.000 g，置具塞錐形瓶中，精密加入一定體積的提取溶劑，稱重，在特定條件下超聲處理一定時(shí)間，冷卻，再次稱重，并用提取溶劑補(bǔ)足減失重量，搖勻，過濾，精密量取過濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，HPLC測(cè)定其含量，計(jì)算提取量[13-15]。

1.6.3 測(cè)定

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

1.6.4 綠原酸標(biāo)樣和牛蒡樣品HPLC圖譜

按上述條件測(cè)得綠原酸標(biāo)樣和牛蒡樣品HPLC圖譜見圖1。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of chlorogenic acid sdandard

圖2 牛蒡樣品HPLC圖譜Fig.2 Sample chromatogram of Arctium lappa L．

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 單因素試驗(yàn)

分別以不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮為提取劑，以確定的最佳提取劑為進(jìn)一步研究對(duì)象，確定液料比、提取溫度、超聲處理時(shí)間對(duì)牛蒡綠原酸提取率的影響。

2.2 Central Composite Design（CCD）設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)篩選得到3個(gè)顯著因素，以提取劑的濃度、液料比和超聲處理的時(shí)間3個(gè)因素為自變量，每個(gè)因素編碼水平見表1，根據(jù)相應(yīng)的試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)后，使用Design-Expert 8.0 Trial軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析[16-18]。

表1 CCD試驗(yàn)因素水平及其編碼Table 1 The factors and levels of Central Composite Design

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1.1 提取劑對(duì)綠原酸提取量的影響

甲醇、乙醇、丙酮為提取劑，料液比為 1∶100（g/mL），在室溫下超聲處理30 min，測(cè)得樣品中綠原酸的提取量[19]，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取劑濃度對(duì)綠原酸提取量的影響Fig.3 Effect of extracting agent concentration on extraction yield of chlorogenic acid

相同處理?xiàng)l件，以水為提取劑時(shí)綠原酸的提取量為0.95 mg/g，由圖3可見3種提取劑均可顯著增加牛蒡中綠原酸的提取量，并隨著提取劑濃度的增加，提取量隨之增加，其中甲醇提取效果最佳，并且濃度達(dá)到50%時(shí)，提取量達(dá)到峰值2.89 mg/g。

3.1.2 料液比對(duì)綠原酸提取量的影響

牛蒡/甲醇料液比對(duì)綠原酸提取量的影響結(jié)果見圖4所示。

圖4 牛蒡/甲醇料液比對(duì)綠原酸提取量的影響Fig.4 Effect of Arctium lappa L./methanol ratio on extraction yield of chlorogenic acid

以50%甲醇為提取劑，牛蒡中綠原酸的提取量隨提取劑的增加而逐漸提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶100（g/mL）時(shí)，提取量達(dá)到最高，并保持平穩(wěn)狀態(tài)。

3.1.3 提取溫度對(duì)綠原酸提取量的影響

以50%甲醇為提取液，以1∶100（g/mL）的料液比，考察提取溫度對(duì)綠原酸提取量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取溫度對(duì)綠原酸提取量的影響Fig.5 Effect of extracting temperature on extraction yield of chlorogenic acid

試驗(yàn)表明過低的溫度（低于20℃）會(huì)顯著影響綠原酸的提取量，提取量隨著溫度的增加而增大，當(dāng)溫度達(dá)到30℃以上時(shí)，則趨于穩(wěn)定。

3.1.4 超聲處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取量的影響

超聲處理可加速溶劑穿透組織的作用，縮短浸提的時(shí)間[20]，超聲處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取量的影響見圖6所示。

圖6 超聲處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic waves extracting time on extraction yield of chlorogenic acid

試驗(yàn)表明，隨著超聲時(shí)間的延長，綠原酸的提取量隨之增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)即可獲得理想的效果，提取量達(dá)到2.89 mg/g，30 min后，超聲時(shí)間的延長并不能增加綠原酸提取量。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其結(jié)果如表2所示，方差分析見表3。

表2 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及其結(jié)果Table 2 The CCD experiment design and response values

表3 牛蒡中綠原酸提取量的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for the yield of chlorogenic acid with various extraction conditions

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-Expert8.0Trial軟件進(jìn)行二次回歸擬合后，得到如下回歸方程：

方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，R2=91.31%，方程回歸性顯著。預(yù)測(cè)模型的使用條件牛蒡甲醇料液比為1∶80（g/mL）～1 ∶120（g/mL），提取劑甲醇濃度為 40%～60%、超聲提取的時(shí)間為20 min～40 min，在此條件下可以用該模型預(yù)測(cè)牛蒡中綠原酸的提取量。

利用Design-Expert8.0Trial軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面立體分析圖（圖7～圖9）對(duì)回歸方程求解，得到模型極值點(diǎn)，即牛蒡甲醇料液比為1∶100（g/mL）、提取劑甲醇濃度為50%、超聲提取的時(shí)間為30 min，此條件下可以牛蒡綠原酸的提取量達(dá)3.244 mg/g。

圖7 甲醇濃度和液料比對(duì)綠原酸提取量交互作用的相應(yīng)面Fig.7 Response surface showing the effects of methanol concentration and material/water ratio on extraction yield of chlorogenic acid

圖8 甲醇濃度和超聲處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取量交互作用的相應(yīng)面Fig.8 Response surface showing the effects of methanol concentration and ultrasonic waves extracting time on extraction yield of chlorogenic acid

圖9 液料比和超聲處理時(shí)間對(duì)綠原酸提取量交互作用的相應(yīng)面Fig.9 Response surface showing the effects of material/water ratio and ultrasonic waves extracting time on extraction yield of chlorogenic acid

3.3 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在預(yù)測(cè)最佳提取條件下平行試驗(yàn)3次，牛蒡中綠原酸實(shí)際提取量為3.173 mg/g，與預(yù)測(cè)值3.244 mg/g接近，證明該模型能較好的預(yù)測(cè)綠原酸的實(shí)際提取量。

3.4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)篩選得到3個(gè)顯著因素，提取劑的濃度、液料比和超聲處理的時(shí)間。以上述3個(gè)因素為自變量設(shè)計(jì)了CCD試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明其最佳水平分別為牛蒡甲醇料液比為1∶100（g/mL）、提取劑甲醇濃度為50%、超聲提取的時(shí)間為30 min，此條件下可以牛蒡綠原酸的提取量達(dá)3.244 mg/g。在最佳提取條件下，非重要因子及其水平分別為：超聲波溫度為30℃。

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Optimization of Extraction Process for Chlorogenic Acid from Actium lappa L.by Response Surface Analysis

ZHANG Man1，LI Shuang2，WAN Guo-fu1，ZHANG Lan1
（1.Jiangsu Food and Pharmaceutical Science College，Huai′an 223003，Jiangsu，China；2.Qingdao J&C Testing Technology Services Co.，Ltd.，Qingdao 266071，Shandong，China）

The paper studied the extraction amount of chlorogenic acid from off-grade Arctium lappa L．by a single factor test the factors such as methanol extraction agent，concentration of extractant，liquid/material ratio and ultrasonic treatment time were determined.The Central Composite Design and result analysis proved that the optimal extraction condition for three important factors were methanol concentration 50%，solid to liquid ratio 1 ∶100（g/mL），extracting time 30 min respectively.Under this condition the extraction amount of chlorogenic acid from Arctium lappa L．was 3.244 mg/g.

Arctium lappa L．；chlorogenic acid；ultrasonic wave extraction；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.007

江蘇省淮安市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（SN13087）

張嫚（1975—），女（漢），副教授，碩士，從事食品安全與質(zhì)量控制研究。

2017-05-04