電針對2型糖尿病大鼠右心房自主神經(jīng)損害的調(diào)節(jié)作用

祝恩智，李南溪，張 宇，高婉寧，王洪峰，逄紫千

（長春中醫(yī)藥大學, 長春 130117）

電針對2型糖尿病大鼠右心房自主神經(jīng)損害的調(diào)節(jié)作用

祝恩智，李南溪，張 宇，高婉寧，王洪峰，逄紫千*

（長春中醫(yī)藥大學, 長春 130117）

目的 探討針刺對2型糖尿病大鼠右心房自主神經(jīng)損害的調(diào)節(jié)水平，為針刺臨床優(yōu)化選穴提供參考依據(jù)。方法 60只SD雄性大鼠隨機分為4組，空白對照組、DM模型組、電針1組、電針2組。除空白對照組外，其余3組給予高脂高糖喂養(yǎng)4周后，用STZ 25 mg/kg連續(xù)2 d腹腔注射制作實驗性糖尿病大鼠模型。造模2周后，空白對照組和DM模型組不予治療；電針1組：選內(nèi)關(guān)、曲池、后三里、三陰交；電針2組：選肺俞、心俞、胰俞、脾俞、腎俞，1次/d，6 d為1個療程，連續(xù)治療4個療程，療程間休息1 d。Elisa法檢測4組大鼠右心房心肌中酪氨酸羥化酶（TH）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、神經(jīng)生長因子（NGF）、生長相關(guān)蛋白- 43（GAP- 43）、睫狀神經(jīng)生長因子（CNTF）等含量。結(jié)果 與空白對照組比較， DM模型組ChAT顯著下降（p＜0.05），NGF有明顯上升（p＜0.05），GAP- 43和CNTF有明顯下降（p＜0.05）；與DM模型組相比較，2個電針組的ChAT有明顯上升（p＜0.05），NGF有明顯下降（p＜0.05），GAP- 43和CNTF均有明顯上升（p＜0.05），且電針1組優(yōu)于電針2組。結(jié)論 電針肢體腧穴對DM模型大鼠FPG有良好的調(diào)整作用，電針能夠良性調(diào)節(jié)右心房TH、ChAT、NGF、GAP-43、CNTF的水平，減輕心臟自主神經(jīng)纖維損害程度，且肢體腧穴組優(yōu)于背俞穴組。

2型糖尿??；心臟自主神經(jīng)病變；電針療法

糖尿病心臟自主神經(jīng)病變（DCAN）是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，但早期因沒有臨床癥狀或癥狀不典型而未引起足夠的重視。DCAN患者發(fā)生房顫、室性心律失常和無痛性心肌梗死的危險性明顯多于未并發(fā)DCAN的患者。針灸對糖尿病具有良好的治療優(yōu)勢，但針灸調(diào)節(jié)DM模型大鼠并發(fā)DCAN的研究還較少。項目組對針灸治療糖尿病的處方進行優(yōu)化，并對肢體選穴和軀體選穴（背俞穴）2種腧穴配伍方法對比觀察，采用ELISA法檢測大鼠右心房心肌中的TH、ChAT、NGF、GAP- 43、CNTF的含量，旨在揭示針灸對DCAN心臟自主神經(jīng)損害的調(diào)節(jié)水平，并選出最簡便的腧穴配伍規(guī)律，為DCAN的早期臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用SPF級健康雄性SD大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量200～220 g，動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫（22±2）℃，相對濕度30%～40%，晝夜循環(huán)通風，自由攝食和水。本組動物實驗經(jīng)過我校動物倫理委員會評估合格。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素（STZ）（美倫生物出品，Lot:M0222A，儲存條件：2～8 ℃）；ChAT、TH、TGF、GAP- 43、CNTF 5種ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司，國內(nèi)分裝，批號：20161215）。

1.1.3 儀器設(shè)備 酶標儀（型號：SynergyMx/SMA）；血糖儀（型號：HEA-STP30）；血糖試紙（批號：161653111B）；電子針療儀（型號：SDZ-V）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分4組：空白對照組，DM模型組，電針1組,電針2組，每組15只。DM模型制備方法[1]：空白對照組給予純凈水和大鼠正常維持飼料，其余3組大鼠給予含10%高脂+ 0.4%膽酸鹽的飼料和10%葡萄糖純凈水喂養(yǎng)。4周后給予STZ（臨用前用pH值4.2～4.5的0.1 mol/L檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液避光條件下配成1%濃度溶液）25 mg/kg連續(xù)2 d腹腔注射，空白對照組大鼠給予等量，相同方法檸檬酸鈉一檸檬酸緩沖液腹腔注射以平衡實驗。 STZ注射后3 d測隨機血糖（RBS）和空腹血糖（FPG），以RBS ＞ 11.1 mmol/L作為成模標準[1]。

1.2.2 針刺治療分組及選穴 空白對照組：不做任何處理；DM模型組：參加模型復(fù)制，但不做針刺治療；電針1組：參加模型復(fù)制，針刺：內(nèi)關(guān)、曲池、后三里、三陰交；電針2組：參加模型復(fù)制，針刺：肺俞、心俞、胰俞、脾俞、腎俞。大鼠腧穴定位標準參照《實驗針灸學》[2]。

1.2.3 針刺方法 電針1組取仰臥位，電針2組取俯臥位。直刺進針，平補平瀉，加電針，使用疏密波，脈沖強度8 Hz。1次/d，20 min/次，6 d為1療程，連續(xù)治療4個療程，療程間休息1 d。

1.2.4 生化檢測方法 4組大鼠隔夜禁食，次日測量FPG，1.5%戊巴比妥鈉，30 mg/kg腹腔注射麻醉，組織剪開胸，立即剪取大鼠右心房，稱取0.2 g心肌組織，組織剪剪碎，加入2 mL 4 ℃的0.9%氯化鈉溶液，冰水浴勻漿1 min（5檔），制備10%心肌組織混懸液，4 ℃，3 000 r/min，15 min，取上清液，用蛋白定量試劑盒進行定量，并調(diào)整總蛋白濃度。采用ELISA法檢測TH、ChAT、NGF、GAP-43、CNTF含量，方法參照試劑盒說明書。標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL。樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL,空白孔不加。標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL， 37 ℃恒溫箱60 min。棄去液體，加入洗液，洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，在15 min內(nèi)，將試劑盒放在酶標儀中，在450 nm波長處測定OD值。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用χ2分析，p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌中TH、ChAT含量比較 見圖1。

2.2 各組心肌中NGF、GAP-43、CNTF含量比較 見圖2。

圖1 各組大鼠右心房TH、ChAT含量變化

圖2 各組大鼠右心房NGF、GAP-43、CNTF含量變化

3 討論

糖尿病患者出現(xiàn)心臟自主神經(jīng)癥狀的概率為20 % ～80 %[3]，而且在早期就會出現(xiàn)，但癥狀隱匿不易被發(fā)現(xiàn)[4]。糖尿病患者短期連續(xù)測量血糖變異及2年糖化血紅蛋白變異監(jiān)測均與DCAN有明顯相關(guān)，證實短期和長期糖尿病均可引起DCAN，且失神經(jīng)支配和交感-迷走失衡存在時間依賴性[5-9]。本項目組研究高脂高糖誘導4周，STZ腹腔注射6周時，DM大鼠右心房TH、ChAT、NGF、GAP-43、CNTF的含量特征和電針調(diào)節(jié)水平。DM大鼠表現(xiàn)為體質(zhì)量上升緩慢，F(xiàn)PG和RBS顯著上升，麻醉狀態(tài)下心率明顯下降。

本項目組突破傳統(tǒng)的循經(jīng)取穴原則，根據(jù)病證部位結(jié)合腧穴所在神經(jīng)節(jié)段性分布的特點進行選穴。電針1組選取上肢C5～T1，下肢L2～S2的肢體腧穴。曲池屬手陽明大腸經(jīng)，后三里屬足陽陽胃經(jīng)，二穴合用取治痿獨取陽明之意；內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，三陰交為足三陰經(jīng)的交匯穴，二穴相配可補益心腎，養(yǎng)血柔筋。4穴遠近相配，標本兼治，增強腧穴配伍的協(xié)同效應(yīng)，起到疏通經(jīng)絡(luò)，滋陰壯元的作用。電針2組選取T1～L2的背俞穴，背俞穴是臟腑之氣輸注背腰部的穴位，取其“從陽引陰，陰病治陽”的腧穴固有生物學特性，起到培本固元，滋陰生津的作用。本實驗的2組選穴大致處于相同的神經(jīng)節(jié)段，2電針組均有效，提示2組選穴均對DM大鼠右心房自主神經(jīng)有良性的調(diào)節(jié)作用。

TH是哺乳動物體內(nèi)兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)生物合成途徑的限速酶，是交感神經(jīng)分布的標記物。ChAT是合成乙酰膽堿（Ach）過程中重要的酶，為膽堿能神經(jīng)元的標記物。

本組DM大鼠在麻醉狀態(tài)下，由于對低血容量的代償能力降低而表現(xiàn)為心率明顯下降。與正常對照組比較，DM模型組大鼠ChAT顯著下降，TH含量有上升趨勢，但無統(tǒng)計學意義；經(jīng)過4周的電針治療，與DM模型組比較，2個電針組ChAT明顯上升。提示DM大鼠自主神經(jīng)以迷走神經(jīng)纖維損害為主，交感神經(jīng)纖維損害程度輕，表現(xiàn)為相對增生，與文獻[10]報道相符合，而電針對于病理性降低的ChAT具有良性上調(diào)的作用。內(nèi)關(guān)穴是治療三焦病癥的要穴，對心、胸、胃、神經(jīng)性疾病起到“調(diào)虛實，平陰陽”的“雙向性保護調(diào)和效應(yīng)”[11]。肺俞和心俞靠近脊髓胸段交感干，交感去甲腎上腺素能纖維和副交感膽堿能纖維支配心房、心室、竇房節(jié)、房室結(jié)、束支和氣管支氣管的擴張和收縮。故筆者根據(jù)實驗結(jié)果推測，電針內(nèi)關(guān)、肺俞、心俞對TH和ChAT的表達有相關(guān)性。

NGF能夠維持交感神經(jīng)的生存和再生，阻止或減輕神經(jīng)元退變并能誘導損傷或病患神經(jīng)元的再生[12]，其過度表達會導致交感神經(jīng)發(fā)生異常增生[13]。實驗發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，DM模型組NGF顯著上升，與TH含量變化趨勢一致。與DM模型組比較，2個電針組NGF明顯下降，提示這一時期，交感神經(jīng)也存在受損和重構(gòu)現(xiàn)象，電針治療可以抑制NGF的過度表達。

GAP- 43是促進軸突生長及神經(jīng)細胞分化的蛋白質(zhì)，通過抑制細胞調(diào)亡參與損傷的修復(fù)[14]，對交感和迷走神經(jīng)均有修復(fù)作用。CNTF可以阻止交感神經(jīng)細胞的增殖并促進其分化，而且還是交感神經(jīng)元的膽堿能分化因子，即CNTF能通過提高ChAT而降低TH的水平，將腎上腺能神經(jīng)元轉(zhuǎn)變?yōu)槟憠A能神經(jīng)元[15]。電針內(nèi)關(guān)、足三里、三陰交等腧穴能夠增強相應(yīng)神經(jīng)節(jié)段及中樞組織中GAP- 43的表達[16-17]。實驗結(jié)果顯示，DM模型組ChAT、GAP- 43、CNTF陽性表達明顯低于正常對照組，提示迷走神經(jīng)纖維退行性減少促進神經(jīng)元再生能力下降。

本項目組所選2組腧穴均對DCAN大鼠的體質(zhì)量、血糖、心率等具有調(diào)節(jié)作用，對右心房自主神經(jīng)具有良性修復(fù)作用。電針治療4周后，2個電針組NGF均明顯下降，ChAT、CNTF、GAP- 43明顯上升，電針1組優(yōu)于電針2組。提示對于DCAN的針刺治療方案優(yōu)選肢體選穴組。筆者在治療心臟自主神經(jīng)病變時，除考慮減輕神經(jīng)損傷選取陽明經(jīng)腧穴外，還以調(diào)整心臟交感-迷走神經(jīng)平衡為重點選取心包經(jīng)腧穴及背俞穴，對減輕心臟自主神經(jīng)重構(gòu)過程中出現(xiàn)的交感-迷走失衡狀態(tài)，維持交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)對心臟的平衡支配起到了有效的雙向調(diào)和作用。本實驗研究為臨床預(yù)防、治療DCAN提供了有效的實驗依據(jù)，為減少其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的自主神經(jīng)病變的針灸治療提供選穴思路。

參與文獻：

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Regulating effect of electroacupuncture in the right atrium autonomic nerve damage of type 2 diabetic rats

ZHU Enzhi, LI Nanxi, ZHANG Yu, GAO Wanning, WANG Hongfeng, PANG Ziqian*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun130117, China)

Objective To investigate the regulating effect of electroacupuncture on the autonomic neurotrophic factor in the right atrium of type 2 diabetic rats, and to provide reference for electroacupuncture clinical optimization.Methods Sixty SD rats were randomly divided into four groups: blank control group, DM model group,electroacupuncture group 1 and electroacupuncture group 2. Except the blank control group, the other three groups were fed with high fat and high glucose for 4 weeks. The experimental diabetic rats were injected intraperitoneally with STZ for 2 days at 25 mg.kg-1. After 2 weeks of modeling, the blank control group and DM model group were not treated; electroacupuncture 1 group: select Neiguan (PC6), Quchi (LI11), Zusanli (ST36), Sanyinjiao (SP6);electroacupuncture 2 group: select Feishu (BL13), Xinshu (BL15), Yishu (EX-B3), Pishu (BL20), Shenshu(BL23).Once a day, six days for a course of treatment, continuous treatment for four courses, one-day rest between the courses. TH, ChAT, NGF, GAP-43, and ciliary, Nerve growth factor (CNTF) in the right atrium of rats were assessedwith ELISA. Results ChAT of DM group decreased signif i cantly (p＜0.05), NGF was increased signif i cantly (p＜0.05),GAP-43 and CNTF were signif i cantly decreased (p＜0.05) in the DM model group compared with the control group;the ChAT of the two electroacupuncture groups increased signif i cantly (p＜0.05) NGF decreased signif i cantly (p＜0.05),GAP-43 and CNTF were signif i cantly increased (p＜0.05) compared with DM model, electroacupuncture group 1 was superior to electroacupuncture 2 group. Conclusion Electroacupuncturing on limbs has a good effect on FPG of DM model rats, electroacupuncture can regulate the right ventricular autonomic neurotrophic factor balance, reduce the degree of autonomic nerve fi ber damage and group of limbs acupoints better than that of group of back transport points.

type 2 diabetes; cardiac autonomic neuropathy; electroacupuncture

R245

A

2095-6258(2017)06-0893-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.011

2017年國家自然科學基金資助項目（81674051）;2016年吉林省教育廳“十三五”科研課題（01080864）;2017年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(國家級)（201710199002）;2016年吉林省高等教育學會高教科研課題（JGJX2016C17）。

祝恩智（1968 -）,男,碩士,副研究員,主要從事中醫(yī)藥實踐教學管理模式的理論研究。

*通信作者：逄紫千,女,碩士,正高級實驗師,電子信箱 - ziqianp@126.com

2017-09-17）