平喘顆粒對哮喘大鼠氣道重塑后表皮生長因子蛋白表達的影響

蔣鵬娜，劉建秋，李竹英,,3*，王雪慧

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

平喘顆粒對哮喘大鼠氣道重塑后表皮生長因子蛋白表達的影響

蔣鵬娜1，劉建秋2，李竹英1,2,3*，王雪慧2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

目的 通過測定哮喘大鼠氣道重塑后表皮生長因子蛋白的表達，探討平喘顆粒對哮喘大鼠氣道重塑的作用機理。方法 將90只Wistar大鼠分為6組 , 每組15只，A、B組予以生理鹽水灌胃，C組予0.5 mg布地奈德霧化吸入（2 次/d），D、E、F組給予中藥低4.01 g/（kg·d）、中8.01 g/（kg·d）、高16.02 g/（kg·d）劑量灌胃。各組均于末次激發(fā)24 h后處死，取大鼠左肺中下段，切成1 mm3左右，并將其用2.5%戊二醛固定，以備電鏡用。大鼠右肺切取后，先用PBS漂洗，吸干后置于液氮罐中速凍，之后保存于－80 ℃冰箱，用于RT-PCR檢測。結(jié)果 平喘顆粒（低、中、高）組、布地奈德組和模型組的EGF mRNA蛋白表達均高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0. 05）。平喘顆粒（低、中、高）組和布地奈德組EGF mRNA蛋白的表達較模型組明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。平喘顆粒（中、高）組EGF mRNA蛋白的表達較布地奈德組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。平喘顆粒低劑量組EGF mRNA蛋白的表達較布地奈德組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 平喘顆?？梢愿纳坪涂刂茪獾乐厮苓^程中氣道高反應(yīng)和氣道阻塞的狀態(tài)，并且可抑制EGF mRNA的表達，從而保護肺部組織細胞，減輕哮喘發(fā)作。

平喘顆粒；氣道重塑；表皮生長因子

支氣管哮喘是臨床常見的呼吸系統(tǒng)慢性氣道疾病，是我國的常見病、多發(fā)病。哮喘是屬于慢性氣道高反應(yīng)性疾病，研究[1]證實，主要與肥大細胞、嗜酸性粒細胞和 T 淋巴細胞有關(guān)。從病理角度來看，長期的慢性氣道病變會進一步加重和刺激氣道結(jié)構(gòu)，造成氣道重塑。氣道重塑是在多種可溶性生長因子和炎性因子等因素參與作用下引起的慢性炎癥對氣道反復(fù)刺激的結(jié)果。表皮生長因子（EGF）是重要的生長因子，它可以促進結(jié)締組織合成，造成氣道重塑，還能加快上皮細胞和成纖維細胞的有絲分裂，進一步促進合成結(jié)締組織[2]。本研究旨在探討哮喘大鼠氣道重塑后EGF蛋白的表達及平喘顆粒在治療過程中的作用靶點及作用機制。

1 材料

1.1 動物 90只Wistar大鼠（健康SPF級），雌雄各半，平均體質(zhì)量（200±20）g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供，合格證書號：SYXK（黑）2015010。隨機分為6組。正常對照組（A）、模型組（B）、布地奈德組（C）、中藥低劑量組（D）、中藥中劑量組（E）、中藥高劑量組（F），每組15只。

1.2 主要試劑 卵蛋白（OVA），Grade V，美國Sigma公司A5503。氫氧化鋁干粉，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司，分析純。氨基甲酸乙脂（烏拉坦）、戊二醛等電鏡所需試劑，均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科提供。

1.3 實驗藥物 中藥：淫羊藿15 g，黃芪10 g，太子參10 g，蜜麻黃10 g，款冬花12 g，五味子10 g，知母10 g，地龍10 g，罌粟殼4 g。加12倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，濾過，再加10倍量水煎煮1 h，濾過，濾液合并，濃縮至相對密度為1.15～1.20（60 ℃）的浸膏即得，制備成每1 kg含81 g生藥顆粒，用溫開水進行稀釋灌胃，根據(jù)人（70 kg）與大鼠(200 g)給藥劑量比值1:0.018換算后，給予大鼠藥液1 mL/100 g灌胃。布地奈德混懸液（普米克令舒），2 mL:1 mg，Astra Zeneca Pty Ltd。

2 方法

2.1 復(fù)制哮喘大鼠模型[3]所有Wistar大鼠先進行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)，之后開始建立哮喘模型，提前將1 mg卵蛋白與100 mg Al(OH)3（氫氧化鋁）凝膠進行預(yù)混制成1% OVA無菌抗原液，在實驗的第0、12天予大鼠腹腔注射，前5 d，每天用5% OV A進行霧化激發(fā)30 min，之后隔1 d 1次，共激發(fā)8周，復(fù)制哮喘模型。A、B組予以生理鹽水灌胃，C組予0.5 mg布地奈德霧化吸入（2 次/d），D、E、F組給予中藥低4.01 g/（kg·d）、中8.01 g/（kg·d）、高16.02 g/（kg·d）劑量灌胃治療[4]。2.2 取材與樣品處理 1）各組均于末次激發(fā)24 h后，用20%烏拉坦，按5 mg/kg腹腔注射麻醉，取大鼠左肺中下段，切成1 mm3左右，并將其用2.5%戊二醛固定，以備電鏡用。2）將上述各組實驗大鼠右肺切取后，先用PBS漂洗，吸干后置于液氮罐中速凍，之后保存于-80 ℃冰箱，用于RT-PCR檢測。

2.3 實驗步驟

2.3.1 電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu) 肺組織在4 ℃，2.5%戊二醛中固定2 h，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次，15 min/次；再用1%鋨酸固定組織塊，4 ℃，3 h，后用蒸餾水漂洗3次，10 min/次；之后進行脫水，脫水后進行包埋；用100%丙酮+2:1包埋液給組織常溫滲透3 h，再用100%丙酮+1:2包埋液給予常溫過夜，在37 ℃下用100%包埋液滲透2 h；然后依次于37 ℃、45 ℃、60 ℃在烘箱內(nèi)固化；最后切成60 nm厚的切片。

2.3.2 RT-PCR法檢測大鼠肺組織生長因子（EGF）mRNA表達 右肺組織用Trizol提取總RNA。以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成DNA，而后進行PCR擴增。按照NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫中EGF的基因序列，使用Prime Premier軟件進行引物設(shè)計，并擴増片段到100-300bp的長度，由Invitrogen（上海）公司進行引物合成。EGF (PCR產(chǎn)物為165bp)上游引物：5’-CTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3’； 下 游 引 物：5’-GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTG-3’。此后進行實時定量PCR檢測，在PCR儀上，將配置好的PCR反應(yīng)溶液進行PCR擴増反應(yīng)，擴增程序設(shè)定為：首先95 ℃預(yù)變性5 min；之后95 ℃變性30 s，循環(huán)40次，最后60 ℃退火45 s，冷卻至55 ℃。

對各擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，之后使用凝膠圖像分析軟件Bandscan 4.5測定目的條帶和GAPDH的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的基因條帶與GAPDH條帶灰度值比值，將其作為EGF mRNA的相對表達量（見表1），進行半定量分析，統(tǒng)計學(xué)處理。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差（x±s）表示，使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）組間差異，以 P ＜ 0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺組織的電鏡結(jié)果 1）正常對照組（A組）：基底細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞等上皮細胞形態(tài)基本正常，細胞器完整，細胞內(nèi)頂端線粒體呈橢圓形，線粒體嵴完整清晰，基底膜無腫脹、無增厚，呈連續(xù)性。纖毛柱狀上皮細胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，細胞間可見清晰的橋粒連接，正常微小管位于纖毛內(nèi)。2）模型組（B組）：基底細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞等上皮細胞的正常結(jié)構(gòu)受損消失、變矮、變性，膠原纖維顯著增多，纖毛變短脫落，微絨毛減少，有的細胞解體，細胞間隙增大，橋粒連接缺無，基底膜不連續(xù)，細胞萎縮，細胞內(nèi)細胞核萎縮、融合，線粒體呈空泡樣腫脹，其內(nèi)浸潤肥大細胞和嗜酸性粒細胞，嗜酸性粒細胞核膜及細胞膜完整，體積較大，大量嗜酸性蛋白顆粒存在于胞漿中，電子密度較高；肥大細胞內(nèi)含均勻小粒，形態(tài)不一，核形不規(guī)則。3）布地奈德組（C組）：基底細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞等上皮細胞變矮，損傷較模型組輕，細胞間可見膠原纖維增生，可見少量肥大細胞、嗜酸性粒細胞；部分纖毛變短減少、倒伏、閉塞壞死；線粒體呈空泡樣變性；細胞間隙略增大，橋粒連接尚清晰完整，基底膜無明顯增厚，基本連續(xù)。4）中藥低劑量組（D組）：基底細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞等上皮細胞變矮，損傷較模型組輕，細胞間可見膠原纖維增生以及少量肥大細胞、嗜酸性粒細胞，橋粒連結(jié)尚清晰完整，部分纖毛變短減少、倒伏、閉塞壞死；線粒體呈空泡樣變性；基底膜無明顯增厚，基本連續(xù)。5）中藥中劑量組（E組）：基底細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞等上皮細胞稍變矮，排列較規(guī)則，損傷較模型組明顯減輕，細胞間未見肥大與嗜酸性粒細胞以及膠原纖維增生，橋粒連接接近正常，胞漿內(nèi)細胞器結(jié)構(gòu)基本完整，線粒體形態(tài)完整，基底膜呈連續(xù)性。6）中藥高劑量組（F組）：與模型組相比較上皮細胞損傷減輕明顯，細胞呈“舒展”狀態(tài)，形態(tài)基本正常，細胞間未見肥大與嗜酸性粒細胞和膠原纖維增生，橋粒連接正常，胞漿內(nèi)細胞器結(jié)構(gòu)完整，纖毛閉塞壞死減少，排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量正常，溶酶體增多，基底膜無增厚，呈連續(xù)性。

3.2 大鼠肺組織EGF mRNA的表達 見表1。

表1 各組大鼠肺組織中EGF mRNA表達比較（x±s）

4 討論

哮喘急性發(fā)作期在中醫(yī)屬于“哮證”范疇，祖國醫(yī)學(xué)對于該病的認識主要源于《金匱要略》和《諸病源候論》，《金匱要略》中將其稱為“上氣”，是關(guān)于哮喘發(fā)作癥狀，最早的典型描述，將其歸屬為“伏飲”的范疇，正是因為這個提法后世絕大多數(shù)醫(yī)家認為哮病的“夙根”是“頑痰伏肺”。在臟腑方面，肺脾腎三臟與“哮證”的關(guān)系最密切。肺司呼吸，可通調(diào)水道，脾主運化，能滲泄水濕，腎司前后二陰，通利水道，三臟通調(diào)，主上中下三焦之水濕，若失調(diào)，則水濕內(nèi)停，痰飲內(nèi)生，引發(fā)伏邪，致哮喘發(fā)作。導(dǎo)師劉建秋教授經(jīng)過多年臨床經(jīng)驗，結(jié)合歷代醫(yī)家的經(jīng)驗，認為哮喘患者由于反復(fù)發(fā)作導(dǎo)致“肺脾腎”虛損愈加嚴重，使得陽虛與痰濁相互交雜，屬于“陽虛痰盛”證型，治療以“溫補腎陽，健脾補肺，祛痰平喘”為原則，總結(jié)出臨床驗方“平喘顆粒”，既能控制哮喘的發(fā)作，還能改善哮喘患者的臨床癥狀。

從支氣管哮喘的病理生理特征表現(xiàn)來講，氣道重塑的表現(xiàn)主要是由于氣道的異常修復(fù)和反復(fù)損傷導(dǎo)致氣道上皮發(fā)生損害和纖維化等基底膜增厚以及細胞外基質(zhì)沉積的病變。從臨床角度來分析，哮喘難以控制的原因主要是由于氣道重塑與不可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性三者之間的惡性循環(huán)。表皮生長因子（EGF）是一類存在于人體內(nèi)可促進或抑制多類細胞生長的多肽[5-6]，是分布于人體各腺體和體液中的常見物質(zhì)，其性狀相對穩(wěn)定，但是血清中的含量較低。EGF可刺激表皮細胞等的增殖，哮喘氣道重塑過程中EGF與其受體EGFR一起作用于氣道重塑信號通路中的下游分子。異常刺激下，氣道組織中EGF與高分泌的肝素結(jié)合，介導(dǎo)了氣道重塑過程。而EGFR的下游的細胞信號通路激活主要是依賴于EGF與EGFR 的結(jié)合，二者的結(jié)合可進一步加重哮喘氣道重塑[7]。

本實驗研究通過觀察哮喘大鼠肺組織的超微結(jié)構(gòu)和EGF mRNA的蛋白表達情況，筆者發(fā)現(xiàn)平喘顆粒（低、中、高）組、布地奈德組和模型組EGF mRNA蛋白的表達均高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各治療組EGF蛋白的表達較模型組明顯降低，其中低劑量組與布地奈德組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。由此可以推斷平喘顆粒可以改善和控制氣道重塑過程中氣道高反應(yīng)和氣道阻塞的狀態(tài)，并且可抑制EGF mRNA的表達，從而保護肺部組織細胞，減輕哮喘發(fā)作。同時通過實驗還發(fā)現(xiàn)平喘顆粒還能影響氣道周圍血管的分布，這可能與氣道周圍的血管重塑也得到了抑制，其機理有待進一步研究。

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Effect of Pingchuan granule on the expression of epidermal growth factor protein after airway remodeling in asthmatic rats

JIANG Pengna1, LIU Jianqiu2, LI Zhuying1,2,3*, WANG Xuehui2
(1. Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2. First Aff i liated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;3. Key Laboratory of Chinese Materia Medica, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

Objective To investigate effect of Pingchuan granule on the expression of epidermal growth factor protein in asthmatic rats after airway remodeling by measuring the expression of epidermal growth factor protein after airway remodeling in asthmatic rats. Methods 90 Wistar rats were divided into 6 groups, 15 in each group, group A and group B were given normal saline by intragastric administration. Group C was inhaled with budesonide (0.5 mg of budesonide suspension, inhaled in compressed atomizer, twice daily), D, E and F were given low dose (4.01 g /kg/d), medium (8.01 g/kg/d) and high (16.02 g/kg/d). Each group was sacrif i ced 24 hours after the last excitation,and the lung tissue of the middle and lower part of the left lung was cut into 1mm × 1mm × 1mm size. The tissue was placed in an EP tube with 2.5% glutaraldehyde and fi xed for electron microscopy. Take part of the right lung tissue, PBS rinse dry water, liquid nitrogen frozen, placed in -80 ℃ refrigerator for RT-PCR detection. Results The expression of EGF mRNA protein in (the low、medium、high) dose Pingchuan granule group and Budesonide group and model group was higher than that in the blank group, and the difference was statistically signif i cant (p＜0.05).The expression of EGF mRNA protein in (the low, medium, high) dose Pingchuan granule group and budesonide group was signif i cantly lower than that in model group (p＜0.05). The expression of EGF mRNA protein in (the medium, high) dose Pingchuan granule group was signif i cantly lower than that in budesonide group but with no statis tical difference (P＞0.05). The expression of EGF mRNA protein in low dose Pingchuan granules group was lower than that in budesonide group, but the difference was not statistically signif i cant. Conclusion Pingchuan granule can improve and control the airway remodeling process of airway hyperresponsiveness and airway obstruction status, and can inhibit the expression of EGF mRNA, thereby protecting the lung tissue cells, reduce asthma attacks.

Pingchuan granule; airway remodeling; epidermal growth factor

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0886-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.009

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81403234）;黑龍江省自然科學(xué)基金項目面上項目（H201481）;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)“優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃”項目（051268）;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究基金項目（2014xy04）;黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃（UNPYSCT-2015120）。

蔣鵬娜（1981 - ）,女,博士研究生,主要從事中西醫(yī)結(jié)合呼吸系統(tǒng)疾病的診治與研究。

*通信作者：李竹英,女,博士研究生導(dǎo)師,電話 - 13945056639,電子信箱 - lizhuying6808@ 126.com

2017-06-01）