亞砷酸鈉致小鼠乳腺癌作用機制研究

董 雪，曹 陽，李 婷，苗晨曦，閻 琪

（長春中醫(yī)藥大學,長春 130117）

亞砷酸鈉致小鼠乳腺癌作用機制研究

董 雪，曹 陽，李 婷，苗晨曦，閻 琪*

（長春中醫(yī)藥大學,長春 130117）

目的 研究亞砷酸鈉（NaAsO2）對小鼠乳腺上皮細胞（NMuMG）的影響,為砷致乳腺癌機制提供理論依據(jù)。方法 以小鼠乳腺上皮細胞為模型，研究亞砷酸鈉對乳腺上皮細胞形態(tài)的影響；經(jīng)流式細胞儀檢測亞砷酸鈉對小鼠乳腺上皮細胞凋亡的影響；實時定量RT-PCR 檢測細胞周期基因P21 mRNAs表達水平。結(jié)果 NaAsO2對NMuMG具有毒性效應，在一定濃度范圍內(nèi)，隨NaAsO2濃度升高，細胞形態(tài)明顯改變，凋亡明顯增多，且呈劑量-效應關系；細胞增殖的抑制基因P21 mRNA水平增高了18.12倍。結(jié)論 亞砷酸鈉可能通過上調(diào)P21基因的表達來抑制NMuMG增殖,可能是砷中毒引起乳腺癌的發(fā)生機制之一。

亞砷酸鈉；增殖；P21基因；乳腺癌

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，是婦女死亡的第二位原因，在過去的50年間，其發(fā)病率逐步提升[1-2]。目前已經(jīng)證明，長期接觸砷可以增加人類腫瘤的發(fā)病率。美國環(huán)境保護協(xié)會和國際癌癥研究中心（IARC）已將砷列為Ⅰ類致癌藥物[3-4]。流行病學[5-7]調(diào)查顯示，地砷病區(qū)其乳腺癌的發(fā)病率高于其他地區(qū)。由于砷致癌機制十分復雜，目前不是十分清楚，在研究砷致癌機制及與乳腺癌的關系之前，筆者先觀察了亞砷酸鈉對小鼠乳腺上皮細胞（NMuMG）的直接毒性效應，觀察在所常見的劑量范圍內(nèi)，對NMuMG的形態(tài)凋亡等影響。

1 材料與方法

1.1 材料 亞砷酸鈉（NaAsO2）、胰島素，購于SIGMA公司；小鼠乳腺上皮細胞（NMuMG）由瑞典大學ARIS教授友情饋贈，Dulbecco’s Modif i ed Eagle Media，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；優(yōu)級胎牛血清購自北京元亨金馬生物公司；CCK-8試劑盒購自于碧云天公司；Trizol試劑盒、RT-PCR 試劑盒購自Takara公司；2 ×SYBR Green Ⅰ試劑購自ABI 公司。Real time-PCR 儀為美國 ABI7300。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) NMuMG培養(yǎng)在含10 %胎牛血清及10 μg/mL胰島素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5 %CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞形態(tài)的觀察 將處于指數(shù)增長期的NMuMG，制成單細胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，加入2.5 mL培養(yǎng)基，待細胞長至70%～80%融合后，換以不同濃度的NaAsO2溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變，并照相。

1.2.3 NMuMG的細胞凋亡測定 各組細胞經(jīng)不同濃度的NaAsO2作用24 h后，用胰酶進行消化，收集之后，分別放再2.0 mL的EP管中，2 000 r/min離心5 min；用事先4 ℃預冷的0.1 mol/L PBS溶液洗滌細胞3次；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入 5 μL Annexin V-FITC 混勻；4℃ 避光 ,孵育 15 min；再加入10 μL PI,混勻；室溫避光，孵育5 min；注意：4組用0 μmol/L NaAsO2處理過的細胞分別加入的是①不加Annexin V-FITC和PI、②加Annexin V-FITC、③加PI、④加Annexin V-FITC和PI。在1 h內(nèi)，進行流式細胞儀的觀察和檢測；用流式細胞儀分析檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

1.2.4 實時定量RT-PCR檢測 分別按照產(chǎn)品說明書，應用Trizol 試劑提取細胞總RNA。應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（具體操作步驟均按廠家產(chǎn)品說明書進行），其反應條件：30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min。c-myc、 c-jun 采用實時定量RT-PCR（SYBR Green 法）進行。反應程序為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；92 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，共50 個循環(huán)。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列見表1 。

表1 PCR擴增所用引物

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)間兩均數(shù)的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下細胞形態(tài)的改變 首先從形態(tài)上，利用共聚焦顯微鏡觀察不同濃度的亞砷酸鈉對NMuMG的影響，DIC照相。0 μmol/L對照組細胞呈鋪路石、上皮細胞形狀，細胞間連接緊密，細胞貼壁生長，狀態(tài)較好；經(jīng)亞砷酸鈉作用24 h后，隨著亞砷酸鈉濃度的提高，細胞間隙逐漸變寬，細胞變長、形狀不規(guī)則，有空泡出現(xiàn)，漂浮的死細胞越來越多。

2.2 NaAsO2引起NMuMG凋亡的測定 用AnnexinV、PI雙染法檢測細胞凋亡，按照流式細胞儀獲取的10 000個細胞散點圖進行分析，Q3區(qū)域內(nèi)為正常細胞，Q4區(qū)域內(nèi)為早期凋亡細胞，Q2區(qū)域內(nèi)為壞死細胞和凋亡末期的細胞。凋亡率（%）= Q2+Q4。在不同濃度NaAsO2作用于細胞后，隨著藥物濃度增加，凋亡細胞數(shù)量也明顯增多。NaAsO2濃度從5 μmol/L開始，與0 μmol/L組相比有顯著差異（P＜0.05），且隨著濃度的升高，凋亡的細胞越來越多，且有劑量-效應關系。（見圖1）。

2.3 NaAsO2促進P21的mRNA表達水平 P21基因是抑制細胞增殖的基因，其表達水平的增高，代表細胞增殖受到抑制[8-10]。經(jīng)20 μmol/L的亞砷酸鈉處理NMuMG 24 h后，收集細胞，提取RNA，實時定量RT-PCR檢測。實驗所得結(jié)果均經(jīng)過內(nèi)參及未處理組校正過，獨立實驗重復3次，每次2個復孔。結(jié)果顯示：經(jīng)20 μmol/L亞砷酸鈉處理的NMuMG，其抑制基因P21的mRNA表達水平明顯升高，升高18.12倍，統(tǒng)計學上均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01 ），結(jié)果說明亞砷酸鈉對NMuMG增殖的抑制作用是通過P21途徑實現(xiàn)的。

3 討論

中國一直是飲水型地砷病嚴重的國家，云南、新疆、吉林等10余省份均是污染大省[11-12]。在地砷病區(qū)，女性乳腺癌的發(fā)病率呈直線上升，嚴重威脅女性健康[13]。為了解砷致乳腺癌發(fā)病機制，本研究以NMuMG為實驗對象，觀察亞砷酸鈉對其毒性作用。

圖1 NaAsO2引起NMuMG細胞凋亡

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)NaAsO2處理后，NMuMG形態(tài)明顯發(fā)生改變，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞間隙擴大，且隨著亞砷酸鈉濃度的升高，凋亡的細胞越來越多。并發(fā)現(xiàn)NaAsO2對NMuMG的增殖具有明顯的抑制作用，呈典型的劑量-效應關系。

P21是一種細胞周期素依賴性激酶的抑制蛋白，通過抑制多種 Cyclin/CDK 復合物的活性來調(diào)節(jié)細胞周期，使細胞周期延長，進而抑制細胞增殖[14]。通過RT-PCR方法檢測P21基因表達水平，筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)20 μM濃度亞砷酸鈉處理的NMuMG，其抑制基因P21的mRNA表達水平升高18.12倍，說明NaAsO2對NMuMG的增殖抑制作用是通過促進P21表達而實現(xiàn)的。

許多實驗都表明，砷化物是通過對抑制細胞的增殖，引起凋亡來發(fā)揮其毒性作用的[15-16]。通過消化系統(tǒng)長期攝入低劑量的砷化物，發(fā)現(xiàn)可以引起大鼠膀胱癌，且主要是引起膀胱上皮細胞的壞死和凋亡[16]。本研究通過觀察不同濃度砷對NMuMG毒性作用證明，砷是通過上調(diào)P21的mRNA表達，使細胞周期延長，進而抑制增殖，這可能是其導致乳腺癌的機制之一。

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Study on the mechanism of sodium arsenite induced breast cancer in mice

DONG Xue, CAO Yang , LI Ting, MIAO Chenxi, YAN Qi*
(Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China)

Objective To study the effect of sodium arsenite (NaAsO2) on mouse mammary epithelial cells(NMuMG), and to provide a theoretical basis for arsenic induced breast cancer mechanism. Methods The effect of sodium arsenite on the morphology of mammary epithelial cells was studied by using mouse mammary epithelial cells as models. The effect of sodium arsenite on the apoptosis of mouse mammary epithelial cells was detected by fl ow cytometry. Cell cycle gene P21 mRNAs expression level was detected by real-time quantitative RT-PCR. Results NaAsO2has toxic effect on NMuMG. In a certain range of concentration, with the increase of NaAsO2concentration,the cell morphology changes obviously, and the apoptosis increases obviously, and dose-response relationship exists.The level of P21 mRNA, an inhibitor of cell proliferation, was increased by 18.12 times. Conclusion Sodium arsenite may inhibit the proliferation of NMuMG by up-regulating the expression of P21 gene, which may be one of the mechanisms of arsenic poisoning caused by breast cancer.

arsenic; proliferation; P21 gene; breast cancer

R914.5

A

2095-6258(2017)06-0880-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.007

吉林省教育廳項目（20163）。

董 雪（1978 -）,女,博士,副教授,主要從事老年病學及地方病學的研究。

*通信作者：閻 琪,女,教授,電話 - 18604309698,電子信箱 - 173424614@qq.com

2017-03-02）