藻藍(lán)蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷的影響

楊莎莎，周 利

（十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

·實驗研究·

藻藍(lán)蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷的影響

楊莎莎，周 利*

（十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

目的 研究藻藍(lán)蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷模型的影響。方法 家兔60只,采用隨機(jī)數(shù)字表編號后隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血-再灌注組,藻藍(lán)蛋白1、2、3組,除假手術(shù)組外均建立心肌缺血-再灌注損傷模型。成模后2 h,藻藍(lán)蛋白1、2、3組用藻藍(lán)蛋白混懸液50 、200、400 mg/（kg·d）灌胃2周,假手術(shù)組和缺血-再灌注組灌等體積生理鹽水對照。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測2 周時家兔各組大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、內(nèi)皮素-1（ET-1）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）及心肌組織丙二醛（MDA）;免疫組化染色檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）陽性表達(dá);反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測缺血區(qū)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） mRNA的表達(dá)。結(jié)果 藻藍(lán)蛋白2、3組 NO 和SOD、eNOS明顯提高, iNOS陽性細(xì)胞數(shù)增多, 缺血區(qū)組織VEGF、VEGFmRNA高表達(dá), ET-1、CK-MB和心肌MDA顯著降低,與模型組比較（P ＜ 0.05）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 藻藍(lán)蛋白對家兔心肌缺血-再灌注損傷有保護(hù)作用。

家兔;藻藍(lán)蛋白;酶;缺血-再灌注損傷;血管內(nèi)皮生長因子

心臟疾病的致死主因多為心肌缺血-再灌注損傷，在搶救和治療過程中，缺血區(qū)心肌在恢復(fù)血供后，由于清除自由基的抗氧化酶SOD合成障礙及氧自由基大量產(chǎn)生，常造成嚴(yán)重的缺血-再灌注損傷及心肌細(xì)胞不可逆損傷[1]。隨著心肌細(xì)胞凋亡、壞死及線粒體功能障礙，ET-1大量產(chǎn)生，NOS活性降低，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮合成和釋放NO不足，造成拮抗ET-1作用減弱，血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性遭受嚴(yán)重破壞[2]。而使用SOD等自由基清除酶可減輕缺血-再灌注造成的組織損傷[3]。藻藍(lán)蛋白具有抗氧化活性、抗炎、抑制脂過氧化物生成等作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)其對腦缺血-再灌注損傷有防治作用，本實驗選用家兔心肌缺血-再灌注損傷模型，研究其對心肌缺血-再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 普通級雄性家兔60只，周齡8周，體質(zhì)量(1.8±0.1) kg，采用隨機(jī)數(shù)字表編號后隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血-再灌注組，藻藍(lán)蛋白1、2、3組，每組12只。家兔購自湖北省實驗動物中心。

1.2 儀器與試劑 TKR-200C小動物呼吸機(jī)(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)；BL-420F生物機(jī)能記錄儀（成都泰盟）；藻藍(lán)蛋白（浙江賓美生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（德國分裝）；MDA、SOD、CK-MB測試盒（南京建成生物工程研究所）；VEGF 及VEGFmRNA測試盒（成都榮海生物試劑有限公司）

1.3 造模及治療 腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉家兔，除假手術(shù)組外，其他4組采用絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支缺血30 min再灌注30 min，反復(fù)缺血-再灌注的方法建立心肌缺血-再灌注損傷模型。假手術(shù)組不結(jié)扎，30 min后關(guān)閉胸腔。胸腔關(guān)閉后即行治療。藻藍(lán)蛋白1、2、3組分別用50、200、400 mg/(kg·d)藻藍(lán)蛋白混懸液灌胃2周，假手術(shù)組和缺血-再灌注組灌等體積生理鹽水對照。

1.4 檢測指標(biāo)及方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定CKMB 、SOD、NO 、MDA、eNOS和 ET-1。免疫組化染色檢測eNOS陽性表達(dá)細(xì)胞[5]。實時熒光PCR法檢測缺血區(qū)組織VEGFmRNA表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0分析軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較先進(jìn)行方差分析，組間差異則采用兩樣本均數(shù)Dunnett檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 家兔心肌及冠狀動脈病理組織切片觀察 缺血-再灌注組肌纖維肥大、心肌纖維縱橫紋模、有溶解、斷裂及脂肪樣變性。冠狀動脈血管管壁損傷、狹窄、血管內(nèi)皮有剝脫并有新生內(nèi)膜、邊緣呈 “峰-谷”等典型理性血管重構(gòu)現(xiàn)象，而假手術(shù)組均無以上病理改變，說明造模成功。藻藍(lán)蛋白2、3組家兔心肌纖維相對缺血-再灌注組縱橫紋清晰、整齊，但肌纖維間質(zhì)仍有少量細(xì)胞增生、肥大。冠狀動脈管腔增大、血管無內(nèi)皮剝脫、邊緣無“峰-谷”現(xiàn)象，新生內(nèi)膜較缺血-再灌注組減少82%，病理性血管重構(gòu)現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 對家兔eNOS、NO、ET-1的影響 見表1。

2.3 對家兔心肌細(xì)胞中iNOS表達(dá)的影響 見表2。

表1 家兔eNOS、NO、ET-1水平比較（x± s,n = 12）

表2 家兔心肌細(xì)胞中i NOS陽性細(xì)胞數(shù)比較（x± s ，n = 12） 個/100

2.4 藻藍(lán)蛋白對家兔酶等相關(guān)生化指標(biāo)的影響 見 表3。

表3 家兔SOD、MDA、CK-MK水平比較（x± s,n = 12）

2.5 藻藍(lán)蛋白對家兔心肌血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響 見表4。

表4 家兔VEGF和VEGFmRNA表達(dá)比較（x± s,n = 12）

3 討論

本實驗病理觀察發(fā)現(xiàn)，藻藍(lán)蛋白2、3組較缺血-再灌注組病理性血管重構(gòu)現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，NO 、SOD和eNOS明顯提高，iNOS陽性細(xì)胞數(shù)增多，冠狀動脈VEGF、VEGFmRNA高表達(dá)， ET-1、CK-MB和心肌MDA顯著降低，提示藻藍(lán)蛋白具有心肌缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。

NO是一種血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)因子，iNOS 和eNOS為NO限速酶，兩者均主要在心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，故其活性的改變將影響NO的生成，對血管內(nèi)皮功能具有調(diào)節(jié)作用[6-8]。藻藍(lán)蛋白可能通過提高eNOS和iNOS來調(diào)節(jié)NO的生成，增加NO合成有利于減輕血管內(nèi)皮損傷。SOD是清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的重要的酶，CK-MB在心肌缺血梗死可反映心肌缺血的嚴(yán)重程度[9]。藻藍(lán)蛋白2、3組SOD明顯提高，提示藻藍(lán)蛋白具有肯定的清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA 及細(xì)胞壞死產(chǎn)物CK-MB的作用，MDA降低是藻藍(lán)蛋白提高SOD活性的直接結(jié)果。ET-1對于維持血管正常結(jié)構(gòu)具有重要作用，其降低有利于維持缺血心肌和血管的正常結(jié)構(gòu)，減輕缺血-再灌注血管病理性重塑，VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖，促進(jìn)血管新生[10-12]。藻藍(lán)蛋白2、3組ET-1顯著降低，VEGF、VEGFmRNA高表達(dá)，提示藻藍(lán)蛋白具有降低ET-1、促使VEGF的調(diào)節(jié)通路開放，使缺血區(qū)大量血管新生，這有利于提高缺血區(qū)血供，減輕心肌缺血-再灌注損傷。

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Effects of phycocyanin on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits

YANG Shasha, ZHOU Li*
（Department of Nephrology, Taihe Hospital, Hubei University of Medical, Shiyan 442000, Hubei Province, China)

Objective To investigate the effect of phycocyanin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits. Methods 60 rabbits were randomly numbered and divided into sham operation group, ischemia reperfusion group and phycocyanin groups1,2,3, myocardial ischemia-reperfusion injury models were established in rabbits except the sham operation group. After modeling for 2 h, the three phycocyanin groups were treated by different dose of phycocyanin suspension of 50, 200, 400 mg/ (kg·d) by gavage for 2 weeks; the sham operation group and ischemia reperfusion group were given the same volume of saline as control. The ELISA assay was used to test the level of MB isoenzyme of CK (CK-MB), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD) activity, endothelin -1 (ET-1), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and malondialdehyde (MDA) in rabbit serum; the positive expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was detected by the immunohistochemical staining; reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in ischemic regions. Results In the phycocyanin group 2 and group 3, the expression level of NO, SOD and eNOS signif i cantly increased, and the number of iNOS positive cells also increased; in the ischemic tissues, the high expressions of VEGF can be detected, but the expression level of ET-1, CK-MB and MDA signif i cantly decreased compared with the modelgroup (P＜0.05), the difference was statistically signif i cant. Conclusion The phycocyanin has protective effects on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits.

rabbit; phycocyanin; enzyme; ischemia-reperfusion injury; vascular endothelial growth factor

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0868-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.003

湖北省科技廳資助項目（15Y29）。

楊莎莎（1984 -）,女,大學(xué)本科,主要從事腎病研究。

*通信作者：周 利,女, 電話 - 18772853929,電子信箱 - yssyangsasajob@126.com

2017-03-07）