HPLC法同時測定舒肝寧注射液中5種成分的含量Δ

支旭然，王覓，宋浩靜，董占軍（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊050051）

HPLC法同時測定舒肝寧注射液中5種成分的含量Δ

支旭然＊，王覓，宋浩靜，董占軍#（河北省人民醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊050051）

目的：建立同時測定舒肝寧注射液中5種成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Symmetry?C18，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm（梔子苷、黃芩苷）、327 nm（綠原酸、野黃芩苷、黃芩素），柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.406 2～26.0 μg/mL（r＝0.999 9）、2.500 0～160.0 μg/mL（r＝0.999 9）、6.562 0～420.0 μg/mL（r＝0.999 9）、0.312 5～20.0 μg/mL（r＝0.999 6）、0.585 9～37.5 μg/mL（r＝0.999 8）；定量限≤31.20 ng，檢測限≤15.60 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為97.72%～101.10%（RSD＝1.21%，n＝ 6）、97.67%～102.40%（RSD＝1.87%，n＝6）、97.64%～101.10%（RSD＝1.31%，n＝6）、96.45%～100.10%（RSD＝1.47%，n＝6）、96.16%～101.10%（RSD＝1.69%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于舒肝寧注射液中5種成分含量的同時測定。

高效液相色譜法；舒肝寧注射液；綠原酸；梔子苷；黃芩苷；黃芩素；野黃芩苷；含量

舒肝寧注射液是一種用于治療急、慢性病毒性肝炎的純中藥復(fù)方注射制劑，具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正和保肝護肝的功效[1-2]。舒肝寧注射液是依據(jù)《傷寒論》中茵陳蒿湯劑組方加減而成，經(jīng)臨床使用多年，療效顯著。作為全新的治療急慢性病毒性肝炎的純中藥制劑，舒肝寧注射液以其高效、安全的特點成為臨床保肝的較好選擇[3]，在保護肝臟正常結(jié)構(gòu)與功能方面有特效[4-5]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究證明，舒肝寧注射液含多種黃酮類成分，水溶性強，生物利用度好，但目前關(guān)于舒肝寧注射液成分研究的報道較少[6-7]，且相關(guān)報道也僅檢測了其中1～2種成分，顯然不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定舒肝寧注射液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷的含量，以為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2487雙通道紫外-可見檢測器（美國Waters公司）；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

舒肝寧注射液（貴州瑞和制藥有限公司，批號：20150912、20150711、20160919、20160311、20160910，規(guī)格：2 mL/支）；綠原酸對照品（批號：LYS2015041901）、黃芩素對照品（批號：HQS2015071302）、野黃芩苷對照品（批號：YHQG2015032301）均購自南京春秋生物工程有限公司；梔子苷對照品（批號：MUST-16020401）、黃芩苷對照品（批號：MUST-16031811）均購自成都曼思特生物科技有限公司，所有對照品純度均＞98%；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～23 min，25%→75%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：238 nm（梔子苷、黃芩苷）、327 nm（綠原酸、野黃芩苷、黃芩素）；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱定待測成分對照品各適量，加甲醇制成綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷質(zhì)量濃度分別為1.3、1.6、1.2、1.0、1.5 mg/mL的單一對照品貯備溶液。分別量取上述單一對照品貯備溶液適量，加甲醇制成綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷質(zhì)量濃度分別為 26.0、160.0、420.0、20.0、37.5 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品200 μL，置于10 mL量瓶內(nèi)，加甲醇定容，經(jīng)0.22μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按舒肝寧注射液處方和工藝制備缺茵陳、梔子、黃芩苷、野黃芩苷、黃芩苷的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成缺綠原酸、缺梔子苷、缺黃芩苷和缺野黃芩苷、黃芩素的陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰計均＞5 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，采用倍比稀釋法，用甲醇逐級稀釋，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸?；貧w方程與線性關(guān)系見表1。

2.5 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表1。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰面積的RSD分別為 1.80%、1.02%、0.59%、1.34%、0.85%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程、線性范圍與定量限、檢測限Tab 1 Regression equation，linear ranges and limits of quantify，limits of detection

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20150912）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰面積的RSD分別為0.89%、1.03%、1.89%、1.20%、1.25%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品（批號：20150912）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷峰面積的RSD分別為0.78%、0.69%、1.54%、1.13%、1.18%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：20150912）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取5批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3，μg/g）

3 討論

查閱文獻[8-9]可知，綠原酸檢測波長為327 nm，梔子苷為238 nm，黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷可在275 nm檢測定量。通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和野黃芩苷在238 nm和327 nm均可被檢測，但黃芩苷在327 nm響應(yīng)太高，標(biāo)準曲線受影響；黃芩素在238 nm響應(yīng)比較低，含量少時不易被檢測。因此，本研究選用雙波長238 nm（梔子苷、黃芩苷）和327 nm（綠原酸、黃芩素、野黃芩苷）檢測，在此條件下，所需檢測的各成分色譜峰分離度及峰形均佳，靈敏度較高。

舒肝寧注射液是由茵陳提取物、梔子提取物、黃芩苷、板藍根提取物、靈芝提取物組合而成的中藥注射液。茵陳藥材中主要成分為綠原酸[10]；梔子藥材中主要成分為梔子苷[11]；板藍根藥材中含有表依告春和腺苷[12]，預(yù)試驗中表依告春沒有檢測到，腺苷同時也是靈芝的有效成分，不具有專一代表性[13]；本研究在測定黃芩苷的同時也檢測到了野黃芩苷和黃芩素，從樣品測定結(jié)果可以看出，野黃芩苷和黃芩素在不同批次中含量變化不大，猜測原料藥黃芩苷不純。因此，經(jīng)過篩選，確定本試驗檢測綠原酸、梔子苷、黃芩苷、黃芩素、野黃芩苷作為舒肝寧注射液質(zhì)量控制的主要研究成分。

本試驗分別以甲醇-磷酸（0.05%、0.1%、0.4%）、甲醇-甲酸為流動相進行預(yù)試驗。結(jié)果顯示，采用甲醇-0.4%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，待測成分的分離效果和峰形良好，干擾成分少，基線平穩(wěn)。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于舒肝寧注射液中5種成分含量的同時測定。

[1]梁海雄，黎麗群.舒肝寧注射液治療慢性乙型病毒性肝炎臨床研究Meta分析[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，11（8）：1057-1066.

[2]關(guān)妮.舒肝寧注射液臨床應(yīng)用進展[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2014，27（10）：1291-1295.

[3]張瑾.舒肝寧注射液對順鉑中毒小鼠肝臟損傷的保護作用[J].中國藥房，2016，27（7）：920-922.

[4]張斌，趙巍，王立蓉.舒肝寧注射液對慢性乙型病毒性肝炎高膽紅素血癥患者肝功能及膽紅素的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，20（16）：71-73.

[5]陳端進.脫氧核苷酸鈉聯(lián)合舒肝寧注射液治療肝損害的臨床效果分析[J].海峽藥學(xué)，2013，25（9）：130-132.

[6]曲彩虹，孟小斌，羅宇燕.HPLC測定舒肝寧注射液中綠原酸的含量[J].中藥材，2013，36（6）：1014-1016.

[7]何峰，張昀.HPLC法同時測定舒肝寧注射液中表告依春和腺苷的含量[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，40（12）：1338-1340.

[8]趙亮，王新霞，呂磊，等.HPLC法測定清肝散結(jié)顆粒中黃芩苷、漢黃芩苷、野黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素[J].中成藥，2014，36（2）：313-318.

[9]徐強.HPLC法同時測定茵梔黃分散片、顆粒、膠囊中綠原酸、梔子苷與黃芩苷[J].中成藥，2013，35（5）：967-970.

[10]曹錦花.茵陳的化學(xué)成分和藥理作用研究進展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2013，30（6）：489-494.

[11]孟祥樂，李紅偉，李顏，等.梔子化學(xué)成分及其藥理作用研究進展[J].中國新藥雜志，2011，20（11）：959-967.

[12]任國萍，李錚，傅欣彤，等.HPLC法同時測定板藍根藥材中尿苷、鳥苷、（R，S）-告依春和腺苷[J].中國新藥雜志，2012，21（19）：2330-2334.

[13]席桂同.高效液相色譜法測定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量[J].世界中醫(yī)藥，2014，9（7）：934-940.

Simultaneous Determination of 5 Components in Shuganning Injections by HPLC

ZHI Xuran，WANG Mi，SONG Haojing，DONG Zhanjun（Dept.of Pharmacy，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the simultaneous determination of 5 components in Shuganning injections.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Symmetry?C18column with mobile phase consisted of methanol-0.4%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavlengths were set at 238 nm（geniposide，baicalin）and 327 nm（chlorogenic acid，baicalein，scutellarin）.The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges were 0.406 2-26.0 μg/mL for chlorogenic acid（r＝0.999 9），2.500 0-160.0 μg/mL for geniposide（r＝0.999 9），6.562 0-420.0 μg/mL for baicalin（r＝0.999 9），0.312 5-20.0 μg/mL for baicalein（r＝0.999 6），0.585 9-37.5 μg/mL for scutellarin（r＝0.999 8）.The limits of quantify were no higher than 31.20 ng，limits of detection were no higher than 15.60 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；the recoveries were 97.72%-101.10%（RSD＝1.21%，n＝6），97.67%-102.40%（RSD＝1.87%，n＝6），97.64%-101.10%（RSD＝1.31%，n＝6），96.45%-100.10%（RSD＝1.47%，n＝6），96.16%-101.10%（RSD＝1.69%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，precise，stable and reproducible，and can be used for simultaneous determination of 5 components in Shuganning injection.

HPLC；Shuganning injections；Chlorogenic acid；Geniposide；Baicalin；Baicalein；Scutellarin；Content

R917

A

1001-0408（2017）33-4702-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.26

政府資助省級臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才項目

＊藥師，碩士。研究方向：藥物分析與藥動學(xué)。E-mail：zhixuran@163.com

#通信作者：主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：醫(yī)院藥事管理、中藥質(zhì)量控制。電話：0311-85988604。E-mail：hbghyxb123@163.com

（編輯：張 靜）

2017-02-28

2017-04-25）