液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定輻照魚醬中多種氨基酸及同分異構(gòu)體

邵宏宏，相興偉，王琦，周向陽，周秀錦，沈飚，傅謐妮

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316000)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定輻照魚醬中多種氨基酸及同分異構(gòu)體

邵宏宏1*，相興偉2，王琦1，周向陽1，周秀錦1，沈飚1，傅謐妮1

(1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316000)

建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測(cè)定魚醬中輻照相關(guān)的多種氨基酸及同分異構(gòu)體的分析方法，并建立了輻照魚醬檢測(cè)方法。樣品通過鹽酸水解，采用Waters Sunfire C18柱，0.1%甲酸溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，正離子(ESI+)模式可快速有效分離及準(zhǔn)確測(cè)定輻照魚醬中的對(duì)酪氨酸(p-Tyrosine)、苯丙氨酸(Phenylalanine)及其輻照特異性產(chǎn)物間酪氨酸(m-Tyrosine)和鄰酪氨酸(o-Tyrosine)的含量。在10～500 μg/L范圍內(nèi)，所測(cè)氨基酸及同分異構(gòu)體的線性相關(guān)系數(shù)為0.9985～0.9998，回收率為75.1%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.9%。方法適用于對(duì)含蛋白質(zhì)魚醬中輻照相關(guān)的多種氨基酸和其同分異構(gòu)體的測(cè)定，從而對(duì)其是否經(jīng)過輻照進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

輻照；魚醬；氨基酸；同分異構(gòu)體；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

1 概述

食品輻照可有效控制食品中食源性病原體，減少微生物負(fù)載和蟲害，抑制生理過程和延長(zhǎng)貨架期，被廣泛應(yīng)用于食品加工和貯存領(lǐng)域[1]。香辛料調(diào)味品是應(yīng)用輻照技術(shù)較早且應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一，目前，中國(guó)是亞洲最大的輻照食品生產(chǎn)國(guó)[2]。

輻照對(duì)食品的品質(zhì)和安全性的影響還尚未定論，不當(dāng)?shù)妮椪諘?huì)對(duì)食品的感官、營(yíng)養(yǎng)成分造成一定的影響[3-12]。目前，美國(guó)、歐盟等地區(qū)對(duì)食品輻照有比較詳細(xì)的要求，對(duì)于食品種類、輻照劑量、輻照設(shè)施、食品輻照的標(biāo)示都有明確的規(guī)定。歐盟有關(guān)食品輻照的框架指令1999/2/EC和執(zhí)行指令1999/3/EC分別規(guī)定，所有經(jīng)輻照的食品或含有輻照食品成分的必須在食品標(biāo)簽上標(biāo)明，且允許輻照處理的食品中不包括水產(chǎn)品。

深海魚醬是對(duì)海洋低值魚類的加工和綜合利用后的一種新型的食品，其富含蛋白質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于輻照無二次污染和化學(xué)殘留，并對(duì)漁藥、農(nóng)藥及水產(chǎn)品常用的保鮮劑具有一定的抑制和降解作用，近年來輻照技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品及其制品的加工、運(yùn)輸及儲(chǔ)存過程中的殺菌保鮮，從而延長(zhǎng)貨架期。魚醬制品及其生產(chǎn)的原料來源有可能經(jīng)過輻照處理。

近年來，我國(guó)出臺(tái)了多個(gè)輻照食品的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，受方法本身采用的原理所限，每種方法均適用于特定類型的樣品[13-22]。熱釋光分析法(TL)是輻照水產(chǎn)品和香辛料調(diào)味品檢測(cè)的常用方法，歐盟EN 1788法規(guī)中對(duì)輻照水產(chǎn)品檢測(cè)也采用了該法[23]。魚醬在其加工過程中經(jīng)過了去內(nèi)臟、脫腥處理、蒸煮，尤其是多次漂洗，實(shí)際檢測(cè)過程中很難提取到足夠量的礦物質(zhì)用于熱釋光分析法檢測(cè)，目前對(duì)該類產(chǎn)品的檢測(cè)還存在一定的難度。食品經(jīng)輻照后，產(chǎn)生的羥基自由基會(huì)進(jìn)攻含芳環(huán)的苯丙氨酸的鄰、間、對(duì)位，進(jìn)而生成酪氨酸3種異構(gòu)體——對(duì)酪氨酸(p-Tyrosine)、鄰酪氨酸(o-Tyrosine)和間酪氨酸(m-Tyrosine)[24,25]。除對(duì)酪氨酸外，鄰酪氨酸(o-Tyrosine)和間酪氨酸(m-Tyrosine)本身在基體中不存在。本文基于HPLC-MS/MS技術(shù)，通過測(cè)定苯丙氨酸、酪氨酸及輻照特異性產(chǎn)物o-Tyrosine和m-Tyrosine的含量建立輻照魚醬的檢測(cè)方法。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

樣品：魚醬由舟山市水產(chǎn)加工企業(yè)提供，其原料來源為各類深海低值魚類，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：DL-Tyrosine (CAS：556-03-6，純度≥99.0%)、間酪氨酸(CAS：775-06-4，純度≥99.0%)、鄰酪氨酸 (CAS：2370-61-8，純度≥98.0%)、丙苯氨酸(CAS：150-30-1，純度≥99.0%)均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；分別準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品，用少量水溶解，加水定容至100 mL。使用時(shí)用超純水將上述標(biāo)準(zhǔn)品逐級(jí)稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)前以0.22 μm微孔濾膜過濾。

試劑：丙酮、甲醇均為色譜純，德國(guó)默克公司；去離子水(電阻率18.2 MΩ·cm)，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后使用；甲酸，Riedel deHaen公司；鹽酸。

API3000高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB Sciex公司，配有溶劑脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器；天平(感量0.0001 g)；超聲波清洗器：德國(guó)Elma公司；MSI漩渦振蕩器：德國(guó)IKA公司；3-18K低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；恒溫干燥箱：美國(guó)Thermo Fisher公司；0.22 μm尼龍濾膜過濾頭。

2.2 方法

2.2.1 樣品前處理

將待測(cè)的魚醬充分混勻，攪碎后裝入容器內(nèi)，密封、冷藏(-18 ℃)備用；準(zhǔn)確稱取0.5 g (精確至0.01 g)，經(jīng)前處理后的樣品于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮?dú)夂笊w緊旋蓋，于110 ℃下酸解過夜。取酸解液用濾紙過濾后，置于玻璃離心管中，4 ℃，12000 r/min離心10 min。取上清液5 mL，35 ℃，N2吹干，剩余的液體用冷凍凍干機(jī)凍干。用1 mL 0.1%(V/V)甲酸水溶液溶解，用0.22 μm水相尼龍濾膜過濾。取10 μL濾液用 0.1%(V/V)甲酸水溶液定容至1 mL，即稀釋100倍，2個(gè)濃度的樣品均用HPLC-MS/MS法測(cè)定對(duì)酪氨酸和苯丙氨酸。

2.2.2 色譜及質(zhì)譜條件

2.2.2.1 色譜分離條件

采用Waters Sunfire C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A：0.1%(V/V)甲酸水溶液，流動(dòng)相B：甲醇；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2.2.2.2 質(zhì)譜條件

離子源Turbo V，電離模式ESI+，采集方式MRM模式，離子化溫度(TEM)500 ℃；噴霧電壓5000 V，霧化氣(GS1)55 psi，輔助氣(GS2)60 psi，氣簾氣(CUR)10 psi，碰撞氣(CAD)為 High；入口電壓(EP)12 V，碰撞室出口電壓(CXP)10 V。各化合物的具體采集參數(shù)見表2。

表2 優(yōu)化的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 2 Optimized parameters of mass spectrum conditions

2.2.3 測(cè)定方法

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度為10，20，50，100，500 μg/L的氨基酸及同分異構(gòu)體的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述條件測(cè)定；分別取未經(jīng)任何加工和輻照的待測(cè)樣品及經(jīng)1,7 kGy輻照后的樣品，與待測(cè)樣品一起進(jìn)行前處理和上機(jī)測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品提取方式的選擇

對(duì)2種提取方式進(jìn)行了考察。對(duì)樣品分別進(jìn)行1，2，5，7，10，20 kGy劑量的輻照。將上述樣品分A，B 2組，分別以不同方式進(jìn)行提取和前處理，并將結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。A組樣品加入0.1%(V/V)甲酸水溶液直接提取，均質(zhì)后室溫下超聲振蕩提取30 min，4 ℃溫度下12000 r/min離心后取上清液，加入丙酮于-18 ℃下沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃溫度下高速離心后取上清液N2吹干。B組樣品置于20 mL酸解玻璃管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸，充氮?dú)夂笊w緊旋蓋，于110 ℃下酸解過夜。取酸解液用濾紙過濾后，置于玻璃離心管中，4 ℃，12000 r/min離心后取上清液35 ℃下N2吹干，剩余的液體用冷凍凍干機(jī)凍干。樣品吹干后均用1 mL 0.1%甲酸水溶液(V/V)溶解，用0.22 μm水相尼龍濾膜過濾。

上機(jī)測(cè)定后結(jié)果顯示：A，B 2組中未經(jīng)輻照的樣品中含高濃度的對(duì)酪氨酸和苯丙氨酸，未發(fā)現(xiàn)鄰酪氨酸和間酪氨酸。A組中經(jīng)1,2 kGy低劑量輻照的樣品，未能檢測(cè)到輻照特異性產(chǎn)物鄰酪氨酸和間酪氨酸，而大于5 kGy輻照后的樣品則能檢測(cè)到鄰酪氨酸和間酪氨酸。B組樣品采用鹽酸高溫消解，經(jīng)不同劑量輻照的樣品中均能檢測(cè)到一定量的鄰酪氨酸和間酪氨酸。因此采用1%的甲酸直接超聲提取，在低劑量輻照的樣品中無法提取到足夠量的輻照特異性產(chǎn)物鄰酪氨酸和間酪氨酸用于輻照檢測(cè)。采用鹽酸水解的前處理方式比0.1%的甲酸直接超聲提取具有更好的提取效率，因此選擇高溫酸水解進(jìn)行氨基酸提取。

3.2 高溫水解對(duì)輻照特異性產(chǎn)物的影響

含蛋白質(zhì)食品中的苯丙氨酸經(jīng)輻照后可產(chǎn)生鄰酪氨酸和間酪氨酸，本文通過測(cè)定水產(chǎn)品中是否含這2種同分異構(gòu)體確定樣品是否經(jīng)過輻照，為確定這2種同分異構(gòu)體是輻照水產(chǎn)品的特征性產(chǎn)物，前處理中長(zhǎng)時(shí)間的高溫水解不會(huì)導(dǎo)致樣品中產(chǎn)生鄰酪氨酸和間酪氨酸，對(duì)110 ℃條件下4,8,12,24 h水解后未經(jīng)輻照樣品中的氨基酸進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示樣品中均未檢測(cè)到鄰酪氨酸和間酪氨酸。因此高溫下長(zhǎng)時(shí)間的水解不會(huì)導(dǎo)致樣品產(chǎn)生鄰酪氨酸和間酪氨酸，對(duì)這2種氨基酸作為判斷樣品是否經(jīng)過輻照的特征性產(chǎn)物不會(huì)產(chǎn)生影響。

3.3 樣品水解時(shí)間的優(yōu)化

水產(chǎn)品中氨基酸的測(cè)定通常采用110 ℃下進(jìn)行水解，因輻照后產(chǎn)生的酪氨酸異構(gòu)體含量較少，為保證其完全水解并提高檢測(cè)效率，分別考察了不同水解時(shí)間對(duì)氨基酸回收率的影響，確定110 ℃下最佳水解時(shí)間。結(jié)果顯示(見表3)：樣品經(jīng)8 h以上水解后，各種氨基酸含量從最初的快速增長(zhǎng)逐漸趨于穩(wěn)定，在12～24 h水解后，各含量達(dá)到最高值，在保證水解效率前提下為盡量減少前處理時(shí)間，縮短檢測(cè)周期，水解時(shí)間選擇12 h為最佳。

表3 110 ℃不同水解時(shí)間對(duì)含量(mg/kg)的影響Table 3 Effect of different hydrolysis time on concentrate of amino acid (mg/kg) at 110 ℃

注：ND為未檢出。

進(jìn)一步考察了高溫水解時(shí)間對(duì)各氨基酸回收率的影響。取未經(jīng)輻照的樣品，加入m-Tyrosine和o-Tyrosine的標(biāo)準(zhǔn)溶液使其濃度分別為1000,5000 μg/kg，由于水產(chǎn)品中自身所含苯丙氨酸和對(duì)酪氨酸含量較高，因此加標(biāo)濃度較高。110 ℃水解不同時(shí)間進(jìn)行提取，上機(jī)測(cè)定前取前處理后未添加的空白樣液加入同樣濃度的各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)上機(jī)測(cè)定。通過與前處理后的樣品添加濃度比較計(jì)算回收率，12 h水解后各氨基酸均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求(見表4)，目標(biāo)物無明顯損失。因此選擇高溫酸水解12 h進(jìn)行前處理為最佳。

表4 110 ℃不同水解時(shí)間對(duì)回收率(%)的影響Table 4 Effect of different hydrolysis time on recovery rate (%) at 110 ℃

3.4 色譜條件的優(yōu)化

3.4.1 色譜柱的選擇

由于對(duì)酪氨酸在水產(chǎn)品中大量存在，其與因輻照后產(chǎn)生的鄰酪氨酸和間酪氨酸為同分異構(gòu)體，分子量相同，會(huì)產(chǎn)生相同的MRM離子對(duì)，因此無法只通過MRM離子對(duì)進(jìn)行定性和定量，需結(jié)合各個(gè)氨基酸的出峰時(shí)間進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。并且3種同分異構(gòu)體出峰時(shí)間相近，需要通過液相部分進(jìn)行有效的分離，色譜柱的選擇尤為重要。考察了不同填料及不同規(guī)格的色譜柱對(duì)酪氨酸同分異構(gòu)體及苯丙氨酸的分離效果， Waters Sunfire C18色譜柱能將4種氨基酸有效分離，且峰形較好，并結(jié)合流動(dòng)相的梯度洗脫程序，其余的色譜柱分離效果不佳，無法達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 p-Tyrosine，Phenylalanine及輻照特異性產(chǎn)物m-Tyrosine 和o-Tyrosine MRM總離子流圖Fig.1 MRM total ion current of p-Tyrosine, Phenylalanine and irradiation-specific products m-Tyrosine and o-Tyrosine

注：1為對(duì)酪氨酸；2為間酪氨酸；3為鄰酪氨酸；4為苯丙氨酸。

3.4.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+電離模式下，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，然后對(duì)母離子做子離子全掃描。作為同分異構(gòu)體，p-Tyrosine、m-Tyrosine和o-Tyrosine會(huì)產(chǎn)生相同的離子碎片，但不同氨基酸產(chǎn)生的相同離子碎片的豐度不同。根據(jù)得到的碎片離子信息，選擇豐度較高的2個(gè)特征碎片離子作為該氨基酸定量離子(見表2)。并結(jié)合色譜有效的分離，對(duì)酪氨酸的3種同分異構(gòu)體進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量。

3.5 線性范圍、精密度和檢出限

3.5.1 線性范圍與檢出限

將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.1%甲酸溶液稀釋配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，在對(duì)應(yīng)保留時(shí)間下的定量離子對(duì)應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。定量離子10～500 μg/L，待測(cè)氨基酸線性關(guān)系良好(見表5)。以樣品空白信噪比(S/N)的10倍計(jì)算方法的定量限為20 μg/kg，以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限為6 μg/L，能滿足食品安全的檢測(cè)需要。

表5 4種氨基酸的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 5 Regression equation and correlation coefficient of four kinds of amino acids

3.5.2 回收率與精密度

精密稱取2種來源于不同生產(chǎn)企業(yè)的樣品0.5 g，定量加入標(biāo)準(zhǔn)品，使各氨基酸濃度添加量相當(dāng)于50,100,200 μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定加標(biāo)回收率。結(jié)果表明回收率在75.1%～104.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.9%(見表6)。

表6 待測(cè)氨基酸的平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 6 The average recoveries and relative standard deviation of amino acids to be tested (n=6)

3.6 實(shí)際樣品測(cè)定

分別從國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上及水產(chǎn)加工企業(yè)抽取樣品，測(cè)定時(shí)取未經(jīng)輻照及經(jīng)7 kGy輻照后的魚醬制品，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行前處理，處理后的樣液用HPLC-MS/MS條件分析。未經(jīng)輻照樣品中未發(fā)現(xiàn)o-Tyrosine和m-Tyrosine，但含有較高含量的苯丙氨酸和對(duì)酪氨酸，見圖2。經(jīng)7 kGy輻照后的魚醬中含有m-Tyrosine和o-Tyrosine(見圖3)。經(jīng)樣品測(cè)定結(jié)果顯示：結(jié)合離子對(duì)及不同酪氨酸的出峰時(shí)間進(jìn)行判斷，只在一份樣品中發(fā)現(xiàn)有m-Tyrosine和o-Tyrosine，可判定這類樣品經(jīng)過了輻照處理。這可能與熟食較高微生物衛(wèi)生控制要求有關(guān)，利用輻照可有效殺滅并控制微生物尤其致病菌的生長(zhǎng)，且國(guó)內(nèi)目前允許較低劑量的輻照。

圖2 未輻照樣品MRM圖Fig.2 MRM chromatogram of non-irradiated sample

注：1為p-Tyrosine；2為Phenylalanine。

圖3 經(jīng)輻照后樣品MRM圖Fig.3 MRM chromatogram of irradiated sample

注：1為p-Tyrosine；2為m-Tyrosine；3為o-Tyrosine；4為Phenylalanine。

4 結(jié)論

針對(duì)魚醬制品采用了酸高溫水解的提取方式，可達(dá)到對(duì)待測(cè)物質(zhì)的有效提取。采用了HPLC-MS/MS方法對(duì)輻照樣品進(jìn)行檢測(cè)，可在30 min內(nèi)完成對(duì)輻照相關(guān)多種氨基酸及其同分異構(gòu)體的分離和定量檢測(cè)，解決了氨基酸同分異構(gòu)體難分離、難測(cè)定的問題，為魚醬的營(yíng)養(yǎng)成分分析提供了依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上建立了判斷魚醬制品是否經(jīng)過輻照的有效方法。該方法定性分析結(jié)果可靠、檢測(cè)限低，不需要二次輻照，解決了輻照海產(chǎn)調(diào)味品檢測(cè)無方法可依的問題，尤其是無法提取硅酸鹽用于熱釋光檢測(cè)的樣品的輻照檢測(cè)問題，適用于輻照海產(chǎn)調(diào)味品的快速檢測(cè)。

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DeterminationofAminoAcidsandIsomersinIrradiatedFishPastebyHPLC-MS/MS

SHAO Hong-hong1*, XIANG Xing-wei2, WANG Qi1, ZHOU Xiang-yang1, ZHOU Xiu-jin1, SHEN Biao1, FU Mi-ni1

(1.Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316100, China； 2.Zhejiang Marine Development Research Institute, Zhoushan 316000, China)

A credible HPLC-MS/MS method for determination of isomers of Tyrosine and Phenylalanine is established to identify the irradiated fish paste. The sample is dissolved with hydrochloric acid. The separation is achieved on Waters Sunfire C18column by mobile phase of methanol and 0.1% formic acid for gradient elution. The positive ion (ESI+) mode can be used for rapid and effective separation and accurate determination of the content ofp-Tyrosine, Phenylalanine andm-Tyrosine ando-Tyrosine in the irradiated specific products. In the range of 10～500 μg/L, the linear correlation coefficient of the measured amino acids and isomers is 0.9985～0.9998, the relative standard deviation is less than 8.9%.The method is suitable for the determination of a variety of amino acids and their isomers related to irradiation in protein-containing fish paste, so as to accurately identify whether they are irradiated.

irradiation；fish paste；amino acid；isomers；HPLC-MS/MS

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.032

1000-9973(2017)12-0141-06

2017-07-15 *通訊作者

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ15c200005)；浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2015C32101)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016C37041)

邵宏宏(1981-)，女，工程師，碩士，研究方向：色譜分離分析。