小RNA病毒2C基因及其編碼蛋白的研究進(jìn)展

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·綜述·

小RNA病毒2C基因及其編碼蛋白的研究進(jìn)展

唐曉思，程安春，汪銘書

小RNA病毒2C基因保守性較高，其編碼的2C蛋白是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，在小RNA病毒復(fù)制過(guò)程較早出現(xiàn)，只有在小RNA病毒復(fù)制的過(guò)程中才能產(chǎn)生；具有AAA+族解旋酶活性，參與自噬通路入侵過(guò)程，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，與其他非結(jié)構(gòu)蛋白如2B和3C相互作用從而參與致病進(jìn)程等。 本文對(duì)小RNA病毒2C基因及其編碼蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為開展對(duì)其深入研究提供參考。

小RNA病毒；2C基因；2C蛋白

小RNA病毒(Picornaviridae)，又名微RNA病毒，是引起人類及動(dòng)物發(fā)生疫病的重要病原體之一，包括腸病毒屬、心病毒屬、口瘡病毒屬、鼻病毒屬等主要病毒屬。比較常見的病毒有甲型肝炎病毒(HAV)、口蹄疫病毒(FMDV)、鼻病毒(RV)、柯薩奇病毒(coxAv)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)等。小RNA病毒科基因高度保守，病毒直徑范圍為20～30 nm，無(wú)囊膜，為單股正鏈RNA病毒。該病毒基因組由5′非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)、一個(gè)大的開放閱讀框(open reading frame, ORF)以及3′非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)組成，基因組5′端共價(jià)結(jié)合一個(gè)VPg蛋白，3′末端有一個(gè)polyA尾。小RNA病毒翻譯成熟后，被自身編碼的蛋白切割為3個(gè)前體蛋白區(qū)域，即：P1、P2和P3蛋白，其中P1為結(jié)構(gòu)蛋白，包括VP0(VP2和VP4)、VP1和VP3共4種；P2為非結(jié)構(gòu)蛋白，包括2A、2B和2C共3種；P3也是非結(jié)構(gòu)蛋白，包括3A、3B、3C和3D共4種(圖1)，被切割的蛋白參與病毒復(fù)制的各項(xiàng)生命活動(dòng)[1]。

2C蛋白是小RNA病毒編碼的保守的蛋白之一，與病毒RNA的合成有關(guān)，只有在病毒復(fù)制的時(shí)候才會(huì)產(chǎn)生，是病毒復(fù)制復(fù)合體最核心的成份，且對(duì)衣殼蛋白有特異性的親和力，與病毒的衣殼化及宿主細(xì)胞的凋亡有關(guān)，對(duì)小RNA病毒的致病性具有很重要的作用。不同小RNA病毒屬的2C蛋白在結(jié)構(gòu)上存在不同程度的差異，使其具體功能尚不十分明朗。鑒于小RNA病毒對(duì)于人類和動(dòng)物構(gòu)成的危害，了解2C蛋白的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)人獸共患病的防治具有十分重要的意義。

注：小RNA病毒基因組包括5′非編碼區(qū)、一個(gè)大的開放閱讀框、3′非編碼區(qū)和一個(gè)poly A尾。5′非編碼區(qū)包括一個(gè)Vpg結(jié)構(gòu)和IRES活性位點(diǎn)。The Picornavirus genome contains a 5′-untranslated region (UTR), a large open reading frame, a 3′-untranslated region UTR and a poly A tail. The 5′-untranslated region (UTR) has a Vpg structure and a IRES active site.圖1 小RNA病毒基因組Fig.1 The Picornavirus genome

1 小RNA病毒2C基因序列及蛋白的結(jié)構(gòu)特征

小RNA病毒2C基因位于P2的末端，其N′末端含有與細(xì)胞的膜結(jié)合的區(qū)域包括雙性螺旋結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)預(yù)測(cè)的RNA結(jié)合域，中間含有3個(gè)AAA++ATPase解旋酶活性位點(diǎn)，在其C′末端是一個(gè)富含半胱氨酸的假定鋅指基序[2]。雙性螺旋是指2C基因編碼的N′末端氨基酸分子同時(shí)含有親水性和疏水性兩種基團(tuán)，使其具有結(jié)合細(xì)胞膜、參與病毒復(fù)制復(fù)合體形成的能力；RNA結(jié)合域的產(chǎn)生是由于在其C端部分氨基酸序列富含半胱氨酸，半胱氨酸易與鋅發(fā)生反應(yīng)形成鋅指基序，從而與RNA結(jié)合來(lái)與細(xì)胞膜發(fā)生相互作用；3個(gè)AAA++ATPase解旋酶活性位點(diǎn)包括Walker A、B以及一個(gè)motif C，且motif C和解旋酶SF3超家族成員具有同源性，使2C蛋白具有和解旋酶家族相似的NTP酶活性和解旋酶活性[3-4]。

2C是小RNA病毒編碼區(qū)的非結(jié)構(gòu)蛋白，不同小RNA病毒2C蛋白其N′末端螺旋活性的作用機(jī)制不同。在病毒復(fù)制過(guò)程中，隨著氨基酸的插入，N′末端螺旋活性并不干擾亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)的膜結(jié)合，表明其末端還具有與其他分子相互作用的功能[5]；另外，有研究顯示，2C蛋白在協(xié)同ATP水解機(jī)制中是以六聚體AAA+蛋白的形式進(jìn)行的，雖然六聚體是Studies of a Putative Amphipathic Helix in the N-Terminus of Poliovirus Protein 2C2C蛋白與宿主細(xì)胞相互作用過(guò)程中最主要的表現(xiàn)形式，但是由于在N′末端并沒(méi)有結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的同源性[5-6]，該區(qū)域的氨基酸殘基是否有穩(wěn)定2C蛋白六聚體的能力仍有待于進(jìn)一步研究。

2 小RNA病毒2C蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的定位及分布

病毒感染細(xì)胞后，2C蛋白能夠改變細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，通過(guò)結(jié)合某些細(xì)胞蛋白使細(xì)胞膜形成顆粒狀、囊泡狀的膜結(jié)構(gòu)，從而生成RNA復(fù)制復(fù)合體，為病毒的復(fù)制提供平臺(tái)[7-8]。2C蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)呈現(xiàn)顆粒狀分布，2C蛋白表達(dá)的早期可與細(xì)胞的膜結(jié)合而定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體上。例如，F(xiàn)MDV感染宿主后，會(huì)阻止宿主細(xì)胞物質(zhì)的分泌，即影響物質(zhì)經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體到細(xì)胞表面、溶酶體等部位的分泌。小RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2B定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的重排，只有2B和2C結(jié)合才能阻止物質(zhì)的分泌，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑相關(guān)[9-10]。在病毒感染宿主的早期，2C蛋白在細(xì)胞漿內(nèi)呈散在的點(diǎn)狀分布，隨后逐步占據(jù)細(xì)胞核，在感染的后期，觀察到高爾基體在胞漿內(nèi)的分布分散開來(lái)，表明有細(xì)胞膜的重排現(xiàn)象發(fā)生，此外，病毒感染后2C蛋白會(huì)入侵細(xì)胞核并且使假定復(fù)制復(fù)合體周圍肌動(dòng)蛋白的重新分布，表明感染過(guò)程中均有復(fù)制復(fù)合體的形成[11-12]。因此，2C蛋白是病毒復(fù)制復(fù)合體形成的必不可少的工具，對(duì)病毒形態(tài)的變化起著十分關(guān)鍵的作用。

3 小RNA病毒2C蛋白的功能

3.1具有AAA+族解旋酶活性 RNA病毒在病毒中占了很大的比例，在RNA病毒復(fù)制過(guò)程中，其非結(jié)構(gòu)蛋白包括RNA解旋酶能與病毒的多種酶如聚合酶發(fā)生作用進(jìn)而在病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用，AAA+族解旋酶是RNA解旋酶的一種，2C蛋白具有AAA+族解旋酶活性，但不同病毒屬之間的結(jié)構(gòu)差異及ATP結(jié)合位點(diǎn)的不同使得其ATP活性大小不同，且主要以低聚蛋白結(jié)構(gòu)的形式發(fā)揮作用[3]，但2C蛋白低聚結(jié)構(gòu)的特性對(duì)RNA病毒復(fù)制復(fù)合體的形成到底有何作用尚不清楚。2C蛋白對(duì)宿主細(xì)胞膜重排起非常關(guān)鍵的作用，而這一功能與解旋酶活性息息相關(guān)[13-14]。2C蛋白的解旋活性具有雙向性，但5′-3′方向的解旋效率更高，解旋過(guò)程不需要ATP的參與，具有促進(jìn)RNA雙鏈退火的作用[15]；此外，2C介導(dǎo)的解旋酶活性受Mg2+/Zn2+等二價(jià)金屬離子、pH、溫度、蛋白變性劑等因素的影響，并且是以“非競(jìng)爭(zhēng)性抑制”的方式來(lái)抑制這一活性[15]。2C蛋白的ATPase在RNA解旋酶活性分析、蛋白衣殼組裝、RNA包裝中起著非常重要的作用，但其活性在病毒復(fù)制過(guò)程中的具體作用尚不清楚。

3.2利用自噬通路入侵細(xì)胞 自噬體參與細(xì)胞發(fā)育和老化、抵抗病原入侵和癌癥以及某些神經(jīng)性疾病[16]。Beclin1是一種宿主蛋白，是自噬的中心調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)自噬途徑的多個(gè)環(huán)節(jié)，在協(xié)調(diào)細(xì)胞自噬和防止細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵性的作用[16-18]。波形蛋白(Vimentin)是中間絲(Intermediate Filament)的一種Ⅲ類蛋白，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中占優(yōu)勢(shì)，是形成真核細(xì)胞生物結(jié)構(gòu)特征中很重要的蛋白，與自噬體等細(xì)胞器相關(guān)聯(lián)，具有降解蛋白質(zhì)溶酶體的作用[19]。利用酵母雙雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2C蛋白與自噬因子Beclin1和波形蛋白結(jié)合后，可以阻止自噬體融合物變成溶酶體，進(jìn)而幫助病毒的復(fù)制與存活，此外，在病毒感染宿主細(xì)胞后期，2C蛋白也可以與LC3、Bcl-2等自噬誘導(dǎo)因子共定位，揭示了2C蛋白在病毒的復(fù)制過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用[20-21]。在這個(gè)過(guò)程中，通過(guò)增加自噬誘導(dǎo)劑如雷帕霉素(Rapamycin)后病毒復(fù)制量會(huì)明顯增加，而在使用3-甲基腺素(3-methyladenine)或者利用小RNA干擾技術(shù)來(lái)抑制自噬通路之后，病毒感染細(xì)胞的能力明顯下降，除2C以外，部分小RNA病毒屬的非結(jié)構(gòu)蛋白如2B和3A也有這一功能[22-23]。

3.3誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡 部分2C蛋白在宿主體內(nèi)可以誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。腫瘤壞死因子(TNF-α)是目前發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，在保護(hù)機(jī)體免遭外來(lái)病毒入侵感染過(guò)程中起關(guān)鍵作用，Zheng等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，腸病毒(EV71)感染機(jī)體后，2C蛋白可通過(guò)抑制IκBα的磷酸化來(lái)與TNF-α介導(dǎo)的經(jīng)典通路NF-κB通路發(fā)生相互作用，從而使病毒成功入侵宿主體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[24]。但不是所有的小RNA病毒誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)都是通過(guò)2C來(lái)介導(dǎo)的，如在PV中，3A蛋白扮演這一角色[25]，因此還有待于研究其他小RNA病毒的2C蛋白是否具有這一功能。同時(shí)，2C蛋白可以阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體運(yùn)輸加工蛋白質(zhì)，通過(guò)和宿主細(xì)胞蛋白N-myc和STAT interactor(Nmi)相互作用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。Nmi是一種干擾素(Interferon簡(jiǎn)稱IFN)誘導(dǎo)蛋白，可以抑制IFP35(另一種IFN誘導(dǎo)蛋白)蛋白酶體的降解，2C可與IFP35蛋白相互作用誘導(dǎo)I型干擾反應(yīng)阻止IFN的產(chǎn)生，進(jìn)而有利于病毒自身逃避宿主體內(nèi)的免疫機(jī)制從而在宿主體內(nèi)存活下來(lái)[8,27]。另外，在絕大部分2C蛋白具有N′末端兩性螺旋活性的基礎(chǔ)上，對(duì)FMDV 的2C蛋白研究發(fā)現(xiàn)在其C′末端有類似的α螺旋-Nmi結(jié)合活性位點(diǎn)，可以推測(cè)2C蛋白的N′末端是膜結(jié)合的靶向位點(diǎn)，C′末端則有可能負(fù)責(zé)Nmi從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的重復(fù)利用[5,26]。

4 2C與小RNA病毒其他蛋白的相互作用

根據(jù)研究顯示，2C與其他多種蛋白之間存在相互作用，其中與非結(jié)構(gòu)蛋白2B、3C，衣殼蛋白VP1和VP3研究較多[28-29]。Moffat等(2007)研究發(fā)現(xiàn)FMDV 2C和2B相互作用可導(dǎo)致蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w的分泌過(guò)程受阻，推測(cè)可能是2B和2C發(fā)生相互作用后直接影響了I型主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的轉(zhuǎn)運(yùn)、抗原的遞呈以及細(xì)胞因子的分泌，但并不是所有小RNA病毒2B和2C相互作用都會(huì)使蛋白分泌受阻，比如PV 的非結(jié)構(gòu)蛋白3A發(fā)揮這一功能，因其富含脯氨酸和賴氨酸氨基酸序列對(duì)阻止蛋白物質(zhì)的分泌具有十分關(guān)鍵的作用[10]；3C蛋白是小RNA病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白之一，是一個(gè)蛋白酶可切割多聚蛋白，Banerjee 等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，2C可負(fù)反饋調(diào)節(jié)3C蛋白酶的切割作用，因2C蛋白的氨基酸序列富含絲氨酸可與3C蛋白酶的切割基序發(fā)生相互作用從而抑制其活性，且2C蛋白的這一功能并不體現(xiàn)在細(xì)胞的蛋白酶(如腸激酶、凝血酶、胰蛋白酶等)上，而是通過(guò)與3Cpro形成復(fù)合物而發(fā)揮作用[30]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。Wang等(2012年)通過(guò)利用丙氨酸掃描誘變技術(shù)突變2CATPase涉及與病毒形態(tài)變化有關(guān)的衣殼化和脫衣殼中關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)VP1和VP3與2CATPase氨基酸的C′末端結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用導(dǎo)致病毒形態(tài)的變化[4]，Liu等(2010年)用C-集群人類腸病毒(C-cluster Human enteroviruse/C-HEV)研究人類腸病毒2C和VP3的關(guān)系，C-HEV主要有脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus/PV) 1-3型和11型C-集群柯薩奇A病毒(C-cluster coxsackie A virus /C-CAV)，這兩者唯一的區(qū)別在于對(duì)細(xì)胞識(shí)別受體的不同，作者利用PV和 C-CAV在結(jié)構(gòu)上的共性和區(qū)別再結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)2C和VP3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，證實(shí)了2C與衣殼蛋白VP3存在直接相互作用，并且作用方式是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)而不是RNA-蛋白質(zhì)[31]，但這一相互作用是在RNA結(jié)合之前還是在RNA結(jié)合過(guò)程中與衣殼蛋白發(fā)生的尚不清楚。

5 2C蛋白在防制小RNA病毒感染中的作用

5.1在診斷檢測(cè)中的作用 2C蛋白只有在小RNA病毒復(fù)制的過(guò)程中才能產(chǎn)生，將小RNA病毒滅活后制備的滅活疫苗免疫動(dòng)物后不會(huì)產(chǎn)生抗2C蛋白的抗體，所以將人工表達(dá)的2C蛋白作為抗原建立的間接ELISA，能夠?qū)⒁呙缑庖邉?dòng)物產(chǎn)生的抗體與自然感染動(dòng)物產(chǎn)生的抗體區(qū)別開來(lái)，可用于鑒別診斷[32]。 另外，相較于小RNA病毒的其他非結(jié)構(gòu)蛋白，2C蛋白在宿主感染該病毒后最先被檢測(cè)到，可用于感染的早期診斷[33-34]。

5.2抗病毒新藥研制中的靶標(biāo) 歐盟支持的FP6項(xiàng)目VIZIER(參與復(fù)制的病毒酶的比較結(jié)構(gòu)基因組學(xué))中確定小RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的保守位點(diǎn)可作為抗病毒藥物的作用靶點(diǎn)。如：埃可病毒-30的2C蛋白研究表明，2C具有假定的解旋酶活性且能形成環(huán)狀的六聚體，屬于典型的DNA編碼的SF3解旋酶，有ATPase活性[35]；腸道病毒-76的2C蛋白六聚體的形成依賴于其N′末端的44個(gè)氨基酸殘基[36]；成功獲得針對(duì)2C蛋白的抗腸病毒化合物thiazolobenzimidazoles(TBZE)[37]等。以上研究表明2C蛋白是抗病毒新藥研制中可以利用的良好靶點(diǎn)。

6 展 望

小RNA病毒入侵宿主后，在宿主體內(nèi)形成病毒復(fù)制復(fù)合體，其中2C蛋白是復(fù)制復(fù)合體形成的核心成分，對(duì)病毒的復(fù)制有關(guān)鍵的作用；2C蛋白具有較強(qiáng)的膜結(jié)合能力、易發(fā)生低聚反應(yīng)和易發(fā)生聚合，使2C蛋白表達(dá)純化十分困難。對(duì)2C蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、如何參與到病毒的復(fù)制過(guò)程中以及在病毒復(fù)制各階段的作用、以2C蛋白為靶點(diǎn)的新藥研制等仍是今后研究需要突破的重點(diǎn)。

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Researchadvancesinpicornavirus2Cgeneanditsencodingprotein

TANG Xiao-si, CHENG An-chun, WANG Ming-shu

(AvianDiseasesResearchCenter,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofAnimalDiseasesandHumanHealthofSichuanProvince/InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

Picornaviridae 2C gene is relatively conservative, whose encoded protein is a non-structural protein.The 2C protein is in an earlier detection and only can be detected during virus replicatin.The 2C protein has multiple fuctions: the role of AAA+helicase activity，invasion cells by autophagy pathway, abduction cells on inflammation and apoptosis; the interaction with other proteins such as 2B and 3C that might be induced by 2C protein, which can participate in the pathogenic process in a way. Above all, we mainly outline the reseach advances onPicornaviridae2C gene and its encoded protein, in order to provide some superficial reference for its further study.

picornavirus; 2C gene; encoding protein

Wang Ming-shu, Email: mshwang@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.014

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31472223), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(水禽)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(No.CARS-43-8)和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)(No.2016JPT0004)

汪銘書，Email：mshwang@163.com

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，預(yù)防獸醫(yī)研究所 動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130

R373

A

1002-2694(2017)11-1024-05

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 3147223), the National Technological Support Projects of China (No. 2015BAD12B05) and the Key Laboratory Special Project of Sichuan Province(No.2016JPT0004)

2016-10-24編輯王曉歡