紅麻液泡膜質(zhì)子泵H+-PPase(Hcvp1)基因的克隆、序列分析和表達

李 輝，李德芳，陳安國，唐慧娟，李建軍，黃思齊

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所，湖南 長沙 410205)

土壤的鹽堿化是一個世界性的難題，全球鹽漬土面積約10億hm2，中國鹽漬土面積約占世界鹽漬土面積的10%[1-3]。隨著人類活動的增加，環(huán)境的惡化，不合理的灌溉等因素使鹽堿化土地的面積不斷擴大。隨著世界人口的不斷增加，對糧食的需求也不斷增加[4-5]，人口、糧食、耕地的矛盾不斷加劇，所以探索農(nóng)作物的耐鹽機理，培育耐鹽品種是一項十分重要的任務(wù)。

植物在進化過程中形成了各種生理生化機制來適應(yīng)鹽脅迫，其中鹽離子的轉(zhuǎn)運和吸收是一個很重要的耐鹽機制。液泡是成熟植物細胞中最大的細胞器，在細胞滲透壓的調(diào)節(jié)、離子的吸收和轉(zhuǎn)運、有毒離子的區(qū)域化以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)控等方面具有重要作用[6-7]，而液泡膜上的質(zhì)子泵是實現(xiàn)這些生物功能的關(guān)鍵因素。定位于液泡膜上的H+-PPase的質(zhì)子泵，能夠利用焦磷酸(PPi)為底物，催化H+由細胞質(zhì)進入液泡，形成電化學(xué)梯度，用于各種離子的運輸和積累，維持細胞的離子平衡和滲透壓，保證植物能夠在鹽脅迫下正常生長[8-9]。H+-PPase基因已經(jīng)從多種植物中得到了克隆，如黃瓜、玉米、梭梭、陸地棉、費爾干豬毛菜、剛毛檉柳等[10-15]。大量的研究表明，通過對H+-PPase基因的遺傳轉(zhuǎn)化能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因作物的耐鹽性。Gaxiola等[16]在2001年首次將AVP1 基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超表達AVP1 基因的轉(zhuǎn)基因植株抗鹽性得到增強。Duan等[17]通過在煙草中過量表達液泡膜H+-PPase基因，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草葉肉細胞液泡中的Na+含量更高，耐鹽性更強。

紅麻(Hibiscuscannabinus)是一年生韌皮纖維作物。紅麻纖維是重要的紡織原料，可以用于地毯，麻袋的生產(chǎn)，隨著紅麻多用途開發(fā)利用的研究，紅麻還可以用于建筑板材、紙漿、飼料、麻骨炭等方面[18]。隨著人們對糧食需求的不斷增加，紅麻的生產(chǎn)必須向鹽堿地、灘涂、干旱坡地轉(zhuǎn)移而避免與糧棉油爭地。所以對紅麻耐鹽機理的探索，培育紅麻耐鹽品種對紅麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。目前，紅麻的H+-PPase基因還未見報道，本研究從紅麻耐鹽轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了該基因，克隆了其全長cDNA序列，并對該基因進行了鹽脅迫表達分析，這將為紅麻耐鹽分子設(shè)計育種奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和試劑

中紅麻16號的種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所紅麻育種課題組提供。選取籽粒飽滿，大小均勻的種子，消毒，播種在發(fā)芽盒，置于光照培養(yǎng)箱，晝夜溫度為28，26 ℃，光照13 h/d，培養(yǎng)7 d后，選取植株健壯，長勢一致的紅麻幼苗，移入1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換營養(yǎng)液。在營養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d后進行NaCl脅迫處理，NaCl濃度梯度為0，75，150，250 mmol/L。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)選用10株幼苗。NaCl脅迫處理5 d后取樣，每個處理選取3株幼苗葉片，液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱，用于總RNA的提取。

TRIzol購自Invitrogen 公司， Reverse Transcriptase、Rever Transcriptase inhibitor、Power2(SYBR Real-time PCR Premixture、pMD19-T載體購自TaKaRa 公司，DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 引物設(shè)計

依據(jù)紅麻轉(zhuǎn)錄組序列利用Primer premier 5.0進行引物設(shè)計，NCBI Blast驗證引物準確性，序列由上海生工合成?；蚩寺〉囊镄蛄校篜rimer-F(5′-3′)：ATGTCGGATCATGGATTTA；Primer-R(5′-3′)：

TCATGGTTCGTGTTTAAGGA。

1.3 總RNA的提取

參照天根生化科技有限公司，植物總RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA， 然后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的完整性和純度。

1.4 Hcvp1基因的克隆

提取250 mmol/L NaCl脅迫下紅麻幼苗葉片的總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄合成首鏈cDNA， 以1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：10×LA PCR Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，LATaq(TaKaRa) 0.25 μL， dNTP(2.5 mmol/mL)1 μL，F(xiàn)-primer(10 μmol/mL)0.25 μL，R-Primer(10 μmol/mL)0.25 μL，cDNA 1 μL，dH2O 補足25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃ 3 min，反應(yīng)終止于4 ℃。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，送華大基因進行測序。

1.5 Hcvp1基因的生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找Hcvp1基因的最大開放讀碼框；在NCBI網(wǎng)站((http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對Hcvp1基因的核苷酸序列進行BlastN序列比對，同時利用推測的氨基酸序列進行BlastP比對；利用ClustalW軟件進行Hcvp1基因氨基酸序列同源性比對；用MEGA 6.0構(gòu)建進化樹，分析該基因的進化關(guān)系。用TMHMM-2.0(http：//www.cbs.dut.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測Hcvp1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)，用(http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)推測Hcvp1基因編碼蛋白質(zhì)的等電點和分子量。

1.6 Hvcp1基因在不同NaCl濃度脅迫下的表達特征分析

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析Hvcp1 在不同的NaCl濃度脅迫下的表達特征。熒光定量PCR的引物Primer-F(5′-3′)：GGTGCGGAGGAATTAGTA，Primer-R(5′-3′)：ATGAAAGCAAATCGTGGT；內(nèi)參基因為Actin， 引物為：Primer-F (5′-3′) CAGGCAGTTCTTTCTTTGT；Primer-R (5′-3′) ATCCTCCAATCCAGACACT。qRT-PCR的反應(yīng)體系為(10 μL)：Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture 5 μL，正向引物(Forward primer)0.3 μL，反向引物(Reverse primer)0.3 μL，cDNA 2 μL，H2O 2.4 μL。qRT-PCR的反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min； 95 ℃ 15 s， 61 ℃ 15 s， 72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅麻葉片總RNA的提取

根據(jù)天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒說明書提取250 mmol/L NaCl濃度脅迫的紅麻幼苗葉片的總RNA， 然后用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的完整性和純度。結(jié)果如圖1所示28S、18S和5S 3條帶清晰可見，并且28S條帶的亮度約是18S條帶亮度的2倍，表明RNA結(jié)構(gòu)完整，無污染和降解可以作為反轉(zhuǎn)錄的模板。

2.2 Hcvp1基因的克隆

以紅麻耐鹽轉(zhuǎn)錄組獲得的Hcvp1基因的片段序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異性引物，以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。經(jīng)PCR獲得產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送華大基因公司進行測序。將測序獲得的cDNA序列，通過Blast比對發(fā)現(xiàn)，其與H+-PPase基因高度相似，將其命名為Hcvp1，在GenBank中的登錄號為：KX687919。

圖1 紅麻葉片總RNA凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of kenaf leaf

Marker.2k plus Ⅱ；1.PCR產(chǎn)物。Marker.2k plus Ⅱ； 1.PCR production.

圖3 Hcvp1基因的核苷酸序列和氨基酸序列Fig.3 Nucleotides sequence and predicted amino acids sequence of Hcvp1 gene

2.3 Hcvp1基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)過Sanger測序，該基因cDNA全長2 298 bp，開放閱讀框為2 298 bp，推測其編碼765個氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3)，推測其分子量和等電點分別為80.2 kDa和5.25。用TMHMM-2.0預(yù)測表明Hcvp1基因編碼蛋白質(zhì)具有13個跨膜結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖4 Hcvp1 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Transmembrane region prediction of Hcvp1

將該基因核苷酸序列通過BlastN 比對分析，發(fā)現(xiàn)其與雷蒙德氏棉(XM 012587702)、甜橙(XM 006492028 )、毛果楊(XM 006389360 )、煙草(NM001325218)、和大豆(XM 003528254)的H+-PPase基因核苷酸序列的相似性分別為90%，85%，85%，83%，83%，通過BlastP比對發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的相似性分別為96%，93%，91%，93%，94%。

利用ClustalW軟件分析Hcvp1基因氨基酸序列與具有代表性的雷蒙德氏棉(XM 012587702)、甜橙(XM 006492028 )、毛果楊(XM 006389360)、煙草(NM001325218)、紅麻(KX687919)和大豆(XM 003528254)的H+-PPase基因氨基酸序列進行比對分析(圖5)。結(jié)果表明，Hcvp1基因氨基酸序列與其他植物氨基酸序列的一致性為94.6%，保守的氨基酸多達738個，而非保守的氨基酸僅有27個。

多重比較采用ClustalW軟件進行；不同的標記表示氨基酸殘基不同的保守性；* .完全保守； ：.75%以上；..50%以上和不足50%的保守。

利用MEGA 6.0軟件分析Hcvp1基因的氨基酸序列與具有代表性的雷蒙德氏棉(XM 012587702)、甜橙(SM 006492028 )、毛果楊(XM 006389360 )、煙草(NM001325218)、紅麻(KX687919)和大豆(XM 003528254)的H+-PPase基因氨基酸序列的進化關(guān)系(圖6)表明，紅麻與雷蒙德氏棉的距離最近，這可能是因為兩者都是錦葵科的緣故。紅麻與毛果楊的距離最遠。

圖6 Hcvp1 和其他H+-PPase基因的進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree of Hcvp1 and other H+-PPase genes

圖7 qRT-PCR分析Hcvp1基因在不同NaCl濃度脅迫下的表達Fig.7 Expression analysis of Hcvp1 under different concentration of NaCl by qRT-PCR

2.4 Hvcp1基因在不同NaCl濃度脅迫下的表達特征分析

分別提取0，75，150，250 mmol/L NaCl濃度脅迫下紅麻幼苗葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為qRT-PCR 反應(yīng)的模板，以肌動蛋白做內(nèi)參，進行qRT-PCR 分析，結(jié)果如圖7所示。表明隨著NaCl濃度的增加，Hvcp1基因的表達量不斷增加?？梢奌vcp1基因與NaCl脅迫直接相關(guān)。

3 討論

根據(jù)紅麻耐鹽轉(zhuǎn)錄組測序獲得的轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計引物[19]，從紅麻克隆得到Hcvp1基因，采用多種生物信息學(xué)的方法對Hcvp1基因進行分析，其cDNA全長為2 298 bp，開放閱讀框為2 298 bp，編碼765個氨基酸的多肽。同源序列比較發(fā)現(xiàn)，紅麻的Hcvp1基因序列與雷蒙德氏棉、甜橙、毛果楊、煙草、和大豆的液泡膜H+-PPase 基因的序列高度同源，因此，推測獲得的全長cDNA編碼產(chǎn)物是紅麻液泡膜H+-PPase。

液泡膜H+-PPase在植物耐鹽抗旱、生長發(fā)育等方面具有重要的作用。液泡膜H+-PPase能夠調(diào)節(jié)液泡的pH值，參與Na+、K+等溶質(zhì)向液泡內(nèi)運輸；為Na+、Cl-液泡區(qū)域化提供運輸動力，進而減輕鹽害，降低細胞的滲透壓[20-21]，提高植物的耐鹽能力。本研究通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的提高，Hcvp1基因的表達量也隨著升高?？梢娨号菽+-PPase基因的表達受NaCl脅迫的誘導(dǎo)，且表達量與NaCl濃度直接相關(guān)，所以液泡膜H+-PPase基因在紅麻耐鹽機制中具有重要的作用。

本研究克隆了紅麻Hcvp1基因，并對其在不同NaCl濃度脅迫下的表達模式進行了qRT-PCR分析，這將為后續(xù)開展該基因的功能驗證，揭示紅麻耐鹽機制奠定堅實的基礎(chǔ)。