三氯生對斑馬魚微核率和核異常率的影響

劉旭昊，汪小將，王 凡

（洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽471934）

三氯生對斑馬魚微核率和核異常率的影響

劉旭昊，汪小將，王 凡

（洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南洛陽471934）

為了探討三氯生（TCS）對魚類遺傳毒性，通過半靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法對斑馬魚進(jìn)行染毒，設(shè)置對照組和三個(gè)不同濃度組（0.017 mg/L、0.034 mg/L、0.068 mg/L）的TCS處理組，染毒28 d后，測定斑馬魚外周血紅細(xì)胞的微核率和核異常率。結(jié)果顯示：TCS各處理組紅細(xì)胞的微核率和核異常率顯著升高（P＜0.01），且隨著TCS濃度的增大而增大，呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明：TCS對斑馬魚具有潛在的遺傳毒性。

三氯生；斑馬魚；紅細(xì)胞；微核；核異常

三氯生（Triclosan，TCS），又名三氯新或者三氯沙，不溶于水，是一種廣譜抗菌劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療消毒和日化產(chǎn)品如香皂、牙膏、洗面奶等中，隨著生活污水進(jìn)入自然水體，在城市排水系統(tǒng)、污水處理系統(tǒng)、污泥、河流等水體均可檢測到其存在[1-4]。隨著TCS的應(yīng)用量增加，自然水體TCS的存量隨之增加，動植物甚至人體也開始發(fā)現(xiàn)并蓄積。因其數(shù)量巨大、相對難以降解、生物富集作用、對動植物乃至人體的潛在危害，越來越引起學(xué)者們的重視[5]。

由于TCS在污水處理廠不易被處理，因此污水處理廠的出水排放是TCS進(jìn)入水環(huán)境的主要途徑，從而導(dǎo)致水生生物處于潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)中，國內(nèi)外大量研究表明，TCS對水生生物具有致死、免疫、內(nèi)分泌干擾等效應(yīng)。關(guān)于TCS對水生生物遺傳毒性的研究較少，且出現(xiàn)不同的結(jié)果。劉飛等[6]的研究結(jié)果表明，TCS對紅白鯽具有遺傳毒性；Rodricks等[7]通過TCS對經(jīng)典原核生物和真核生物的研究表明其沒有遺傳毒性。

斑馬魚是一種模式動物，因其基因與人類有著高達(dá)87%的同源性，大多數(shù)試驗(yàn)結(jié)果適用于人類，且易飼養(yǎng)、繁殖快、對污染物的作用敏感，同樣可作為水質(zhì)監(jiān)測、研究的模式生物[8]。因此，以斑馬魚為試驗(yàn)材料，通過檢測其外周血紅細(xì)胞微核率和核異常率，來探討TCS遺傳毒性，為三氯生的合理應(yīng)用、毒理研究、環(huán)境評價(jià)、治理標(biāo)準(zhǔn)等提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)用斑馬魚購自上海觀賞魚養(yǎng)殖中心，體長約2.6～3.1 cm；暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室玻璃水族箱中馴化14 d，24 h不間斷充氧，每日定時(shí)投喂餌料一次，過濾除去餌料殘?jiān)?、排泄物等，每日更換曝氣72 h的自來水，水溫 22±3℃，pH 值 6.9±0.2，不間斷充氧確保溶氧量＞5 mg/L。然后取大小相近、行為敏捷、無病無傷的斑馬魚分組，在60 L玻璃水族箱中進(jìn)行試驗(yàn)。

三氯生（TCS）購自綠森化工有限公司、純度99.5%；吉姆薩原液（Solarbio公司）、二甲基亞砜（分析純）、甲醇（分析純）。以二甲基亞砜為助溶劑，配制濃度為2 g/L的母液，根據(jù)實(shí)際用水量配制染毒液。吉姆薩原液染色前用配套稀釋液稀釋備用。

1.2 毒性試驗(yàn)

通過查閱相關(guān)資料可知，斑馬魚96 h LC50為0.34 mg/L[9]。以此為依據(jù)，設(shè)置對照和3個(gè)TCS處理組（濃度分別為 0.017 mg/L、0.034 mg/L、0.068 mg/L），每組設(shè)2個(gè)平行。每個(gè)水族箱試驗(yàn)用水20 L，投放30尾斑馬魚；水溫、pH值、溶氧等參數(shù)維持馴化時(shí)的數(shù)值。然后以半靜態(tài)染毒法對斑馬魚進(jìn)行染毒，每天換水一次，定時(shí)投喂一次并及時(shí)撈出死亡個(gè)體。

1.3 血涂片制作和數(shù)據(jù)采集

28 d后每組隨機(jī)取5尾斑馬魚，斷尾采血，制作常規(guī)血涂片，甲醇固定15 min，吉姆薩染色10 min，磷酸緩沖液漂洗。然后將染色血涂片放在Motic-BA600Mot全自動顯微鏡下觀察、掃描、拍照，每尾斑馬魚血涂片隨機(jī)計(jì)數(shù)觀察5000個(gè)紅細(xì)胞，記錄并統(tǒng)計(jì)微核數(shù)和核異常紅細(xì)胞數(shù)，最后計(jì)算出核異常率，結(jié)果用千分率（‰）表示。計(jì)算公式如下：

微核率=微核總紅細(xì)胞數(shù)/觀察總紅細(xì)胞數(shù)×1000‰

核異常率=核異常的總紅細(xì)胞數(shù)/觀察總紅細(xì)胞數(shù)×1000‰

1.4 數(shù)據(jù)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件spss13.0分析處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較，記錄的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCS對斑馬魚血紅細(xì)胞形態(tài)的影響

正常斑馬魚的外周血紅細(xì)胞大多數(shù)為橢圓形，少數(shù)為圓形，細(xì)胞膜圓滑而清晰；核區(qū)橢圓型，基本位于細(xì)胞中央，清晰可辨，經(jīng)吉姆薩染色后顯藍(lán)色微偏紫色。胞質(zhì)著色淡，近乎透明。而TCS處理的斑馬魚紅細(xì)胞出現(xiàn)異常，包括微核、不均等縊裂、核位異常、核內(nèi)空泡化、雙核、核不規(guī)則、核質(zhì)外凸、核質(zhì)內(nèi)凹、核碎裂等，其中微核、紅細(xì)胞核質(zhì)外凸、核質(zhì)內(nèi)凹及核內(nèi)空泡化比較常見。

2.2 三氯生對斑馬魚紅細(xì)胞微核率和核異常率的影響

TCS對斑馬魚外周血紅細(xì)胞微核率和總核異常率的影響結(jié)果見圖1。正常斑馬魚有少量外周血紅細(xì)胞出現(xiàn)微核，其空白對照組的微核率為0.49±0.10‰，經(jīng)28 d TCS染毒后，TCS濃度為0.017 mg/L的實(shí)驗(yàn)組微核率為1.29±0.20‰，0.034mg/L實(shí)驗(yàn)組微核率為1.59±0.20‰，0.068 mg/L實(shí)驗(yàn)組微核率為1.99±0.20 ‰，與對照組相比顯著升高（P＜0.01）。且隨著TCS濃度的升高，微核率逐漸升高，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

空白對照組的核異常率為1.45±0.12‰，TCS濃度為0.017 mg/L的染毒組核異常率為2.25±0.11‰，濃度是0.034 mg/L的染毒組核異常率為2.83±0.23‰，濃度是0.068 mg/L的染毒組核異常率為3.33±0.10‰，與對照組相比較，顯著升高（P＜0.01）。且隨著TCS濃度的升高，總核異常率也逐漸升高，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖1 TCS對斑馬魚外周血紅細(xì)胞核異常率和微核率的影響

3 討論

作為食物鏈中連接人類和水體污染的媒介，水生生物，尤其是對外源毒物的反應(yīng)機(jī)制和生物富集類似于哺乳動物的魚類[10]，可以快速測出水環(huán)境中的遺傳毒物，所以常用魚類作為水環(huán)境監(jiān)測的生物。多種化學(xué)物質(zhì)處理水生生物都能使其產(chǎn)生微核。微核是一種染色體異?，F(xiàn)象[11]，關(guān)于微核是如何產(chǎn)生的，大部分的學(xué)者雖然有不同的表達(dá)方式，但基本觀點(diǎn)是相同的。一般認(rèn)為，生物體由于化學(xué)毒性物質(zhì)損傷、放射性照射、細(xì)胞組成成分缺乏等原因，在分裂間期細(xì)胞的染色體受到損傷，分裂中期時(shí)染色體斷裂，在細(xì)胞分裂的后期，向兩極移動的染色體早于這些斷裂的碎片，碎片因而在赤道板附近滯留，當(dāng)其他染色體形成子細(xì)胞核的時(shí)候，落后的碎片就形成了微核。

本研究中TCS處理組均對斑馬魚血液紅細(xì)胞產(chǎn)生了影響，且發(fā)現(xiàn)血液紅細(xì)胞中出現(xiàn)了大微核、小微核和雙微核，可能是由于斑馬魚在水中受到TCS的作用，使染色體損傷、斷裂而導(dǎo)致。試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)斑馬魚血液紅細(xì)胞微核率隨著TCS濃度的增加而升高，斑馬魚血液紅細(xì)胞微核率與TCS濃度之間存在一定的效應(yīng)-劑量關(guān)系。王楊科等[12]研究鎘對泥鰍紅細(xì)胞微核的影響、李倩等[13]研究Cu2+對泥鰍血液紅細(xì)胞微核的影響以及耿德貴等[14]研究乙草胺對中華大蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響和本試驗(yàn)結(jié)果類似。

對于TCS而言，其遺傳毒性可能跟它的降解產(chǎn)物有關(guān)，比如TCS在光催化過程中就能產(chǎn)生二噁英和三氯甲烷等具有遺傳毒性的物質(zhì)[15]；研究表明生物富集作用亦可能和遺傳毒性存在正相關(guān)[16]，所以也可能是因?yàn)門CS的富集作用在斑馬魚體內(nèi)積累，從而對魚類紅細(xì)胞的遺傳物質(zhì)造成損傷，破壞染色體的結(jié)構(gòu)，最終造成微核和核異常率增加。也有實(shí)驗(yàn)表明活性氧自由基的產(chǎn)生和累積也會產(chǎn)生遺傳毒性，因?yàn)榛钚匝踝杂苫梢詫?dǎo)致DNA斷裂，這是微核和核異常形成的直接原因[17]。

三氯生對斑馬魚具有明顯的遺傳毒性，說明對人類存在重大潛在遺傳毒性的可能。隨著三氯生的環(huán)境存量日益增加，需要通過深入研究明確其對環(huán)境動植物和人體的遺傳毒性、生態(tài)毒性和生理毒性。

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Effects of triclosan on micronuclei and nuclear anomalies in erythrocyte of zebrafish

Liu Xuhao,Wang Xiaojiang,Wang Fan

(Department of life science,Luoyang normal university,Luoyang 471934,Henan,China)

To explore the genotoxicity of triclosan to fish,zebrafish were exposed to blank control and three different doses of triclosan solution(0.017 mg/L,0.034 mg/L,0.068 mg/L)by semi-static water contracting contamination method for 28 days.Then,we studied the effects of triclosan on blood erythrocytes micronucleus and nuclear anomalies rate in the zebrafish.It was showed that the micronuclei and nuclear anomalies were significantly increased with the increasing of triclosan concentration(P＜0.01).In addition,there was a dose-effect relationship between triclosan dose and micronuclei,nuclear anomalies.These findings suggested that the triclosan had a potential genotoxicity on zebrafish.

triclosan;zebrafish;rbc;micronucleus;nuclear anomaly

NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金(U1504303)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2016GGJS-119）

王凡，E-mail：31734115@qq.com