燕麥青稞粉對II型糖尿病小鼠糖脂代謝及體內(nèi)氧化應(yīng)激的影響

高曉晗，王利國，張詩文，戴雪伶，張 靜，魏 濤，米生權(quán)，孫雅煊*

（1 北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室 北京 100191 2 谷之禪張家口食品有限公司 河北張家口 075000 3 北京大興興華中學(xué) 北京 102600）

燕麥（Avena sativa L）是一種營養(yǎng)價值全面的全谷物雜糧，為禾本科燕麥屬一年生糧、飼兼用作物，又名莜麥、玉麥、鈴鐺麥。燕麥在全世界范圍內(nèi)種植廣泛，主要栽培種分為有稃和裸粒兩大類型。我國是裸燕麥起源的中心，裸燕麥?zhǔn)呛颖钡貐^(qū)的主要作物。本研究以河北地區(qū)的裸燕麥粉為原料。燕麥中含有豐富的B 族維生素，蛋白質(zhì)以及β-葡聚糖等，具有一定的降脂[1-2]、降糖[3]、抗氧化[4-5]和治療皮炎[6-7]等功效。青稞（Hordeum vulgare）是大麥的一種特殊類型，是我國西藏地區(qū)人們對多棱裸粒大麥的統(tǒng)稱，是該地區(qū)的主要作物，適應(yīng)性廣，抗逆行強(qiáng)。特殊的生長環(huán)境導(dǎo)致青稞有豐富的次生代謝產(chǎn)物[8]，富含具有降血脂[9-10]、清腸、調(diào)節(jié)血糖[11]以及降低膽固醇[12-14]等生理功能的β-葡聚糖及可抗氧化的酚類化合物[15]。以燕麥、青稞為原料的食品雖被廣泛開發(fā)，但仍需充分挖掘其價值，使產(chǎn)品更加安全、健康。

糖尿病分為I 型糖尿病和II 型糖尿病，II 型糖尿病又被稱作非胰島素依賴型糖尿病。至今，糖尿病患者的數(shù)量增長十分快速，預(yù)計到2040年，中國的糖尿病患者數(shù)量可能多達(dá)1.51 億。臨床研究表明糖尿病的發(fā)病機(jī)制是由多種因素聯(lián)合作用的結(jié)果，糖尿病會使機(jī)體氧化損傷程度加劇，生物體內(nèi)自由基的累積會對細(xì)胞及組織器官造成一定程度的氧化損傷，而氧化損傷會加快機(jī)體的衰老進(jìn)程，引發(fā)多種疾病。糖尿病會誘發(fā)很多并發(fā)癥，如心腦血管的病變、糖尿病腎病等[16]。對于治療II型糖尿病，已有很多臨床用藥，如二甲雙胍、阿卡波糖等，然而都有一定的副作用，如胰島素抵抗或腸胃不適等。通過調(diào)節(jié)膳食，增加全谷物的攝入，來緩解II 型糖尿病的各種并發(fā)癥的發(fā)生，是食品科學(xué)領(lǐng)域的研究方向之一。茶葉、仙草、谷物等人們常食用的材料作為天然降血糖的食材而被廣泛關(guān)注[17-18]。本研究通過采用高脂飲食配合小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射誘導(dǎo)II 型糖尿病模型，探討燕麥青稞粉對II 型糖尿病小鼠糖脂代謝及體內(nèi)氧化應(yīng)激作用，以期為青稞燕麥粉的開發(fā)、推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

1.1.1 動物及飼料 SPF 級雄性ICR 小鼠100只，體質(zhì)量20～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

基礎(chǔ)飼料購自北京市博愛科貿(mào)有限責(zé)任公司；高脂飼料配方為基礎(chǔ)飼料52.6%、蔗糖20%、蛋黃粉5%、豬油15%、膽固醇1.2%、酪蛋白5%、膽酸鈉0.2%、磷酸氫鈣1%。高脂燕麥青稞粉組飼料由高脂飼料與燕麥青稞粉1∶1 混合制成?？瞻籽帑溓囡劢M飼料由基礎(chǔ)飼料與燕麥青稞粉1∶1混合制成?；旌媳壤汕捌谠囼炈?。

燕麥青稞粉由谷之禪張家口食品有限公司提供。

1.1.2 材料與試劑 鏈脲佐菌素，美國Sigma 公司；葡萄糖測定試劑盒、甘油三酯（triacylglyceride，TG）試劑盒、膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒和血清胰島素ELISA 試劑盒，南京建成生物工程研究所。1% STZ 配制：取0.5 g STZ，冰浴條件下溶解在pH 值為4.4 的0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，定容到50 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀、冷凍低速離機(jī)、紫外-可見光分光光度計、7180 型全自動生化分析儀，日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的制備 采用小劑量STZ 注射并給與高脂飼料誘導(dǎo)II 型糖尿病小鼠模型。100 只ICR 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為兩組，包括正常組20只，造模組80 只，在屏障動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。適應(yīng)期結(jié)束后，禁食12 h，但可自由飲水。造模組小鼠按50 mg/kg 劑量連續(xù)多次腹腔注射1% STZ溶液，正常組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[19]。腹腔注射STZ 的同時給與高脂飼料。所有小鼠注射3 d 后禁食12 h 檢測空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）濃度。以FBG 濃度大于11.1 mmol/L 為成功模型納入試驗組。動物分為5 組，分別為：空白對照組、空白燕麥青稞粉組（圖表中簡稱空白燕麥組）、高脂燕麥青稞粉（圖表中簡稱高脂燕麥組）組、高脂組、陽性對照組?？瞻讓φ战M給與基礎(chǔ)飼料，空白燕麥青稞粉組給予50%添加燕麥青稞粉的基礎(chǔ)飼料，高脂燕麥青稞粉組給予50%添加燕麥青稞粉的高脂飼料，高脂組給予高脂飼料，陽性對照組給予高脂飼料且每天用200 mg/kg 濃度二甲雙胍灌胃，其余組應(yīng)當(dāng)用溶劑灌胃。

1.3.2 指標(biāo)檢測

1.3.2.1 FBG 含量的檢測 對小鼠采取眼眶采血的方式，使用葡萄糖試劑盒測定FBG。

1.3.2.2 生化指標(biāo)的測定 摘眼球采血1 mL 于EP 管中，低速離心取上清，TG、TC、LDL-c 和HDL-c 的含量均使用全自動生化分析儀檢測。試劑盒測定小鼠中血清胰島素的含量。取肝臟組織，測定MDA、GSH 含量以及SOD、GSH-Px 活力。

1.3.2.3 糖耐量試驗方法 小鼠禁食且自由飲水12 h，在0，0.5，2 h，3 個時間點對各組小鼠進(jìn)行眼眶采血，低速離心取得上清液，使用葡萄糖試劑盒測定3 個時間點的FBG。并計算曲線下的面積。

1.4 腸道菌群的測定

小鼠處死前3 d，置于空籠中收集糞便，每組收集5 g。提取樣本中的DNA，采取16S rDNA 擴(kuò)增子測序（16S rDNA Amplicon Sequencing），利用保守區(qū)設(shè)計通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后對高變區(qū)進(jìn)行測序分析和菌種鑒定。利用單端測序（Single-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行單端測序。通過對Reads 剪切過濾，OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品物種構(gòu)成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 和Duncan 檢驗法，檢驗水準(zhǔn)α取0.05，P＜0.05 表明數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠體重的影響

給予燕麥青稞粉前，測量各組小鼠體重，根據(jù)圖1可看出，高脂燕麥組、高脂組以及陽性對照組與空白對照組和空白燕麥青稞粉組小鼠比較，這3 組小鼠體重較為輕，且同時出現(xiàn)了“三多”的典型的糖尿病癥狀。給予燕麥青稞粉飼料6 周后，各組體重都呈上升趨勢，體重較為穩(wěn)定，無明顯波動幅度，空白對照組與空白燕麥青稞粉組比較，小鼠體重并無明顯差異（P＞0.05）。陽性對照組、高脂燕麥青稞粉組與高脂組比較，小鼠體重并無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠體重的影響Fig.1 Effect of oat barley powder on body weight of diabetic mice

2.2 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠糖耐量的影響

小鼠在6 周喂養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行該試驗，如圖2a所示，各組血糖值在灌胃葡萄糖30 min 后達(dá)到頂峰，之后逐步下降，高脂燕麥青稞粉組、高脂組和陽性對照組血糖值在30～120 min 之間變化緩慢，表現(xiàn)出明顯的葡萄糖不耐受。空白對照組和空白燕麥青稞粉組小鼠血糖在120 min 時恢復(fù)正常。對曲線AUC 進(jìn)行計算，如圖2b 所示，與空白對照組比較，空白燕麥組有顯著差異（P＜0.05），高脂組與空白對照組比較有極顯著差異（P＜0.01），與高脂組相比，高脂燕麥青稞組無明顯差異（P＞0.05）。50%的燕麥青稞粉并不能改善小鼠糖耐量的效果。

圖2 血糖曲線下面積Fig.2 Area under the blood glucose curve

2.3 燕麥青稞對糖尿病小鼠FBG 的影響

在前兩周，高脂組的血糖值與空白對照組相比，存在極顯著差異（P＜0.01）。第6 周，陽性對照組與高脂組比較存在顯著差異（P＜0.05），6 周內(nèi)，空白組與空白燕麥青稞粉組比較無顯著差異（P＞0.05），高脂燕麥青稞粉組與高脂組比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠血脂的影響

高脂組與空白對照組相比，其TC、HDL-c 和LDL-c 水平都存在極顯著差異（P＜0.01），TG 水平存在顯著差異（P＜0.05）。與高脂組比較，高脂燕麥青稞粉組的TC 水平顯著降低（P＜0.05），而TG 水平無顯著差異（P＞0.05），但HDL-c 和LDL-c 的水平極顯著的降低（P＜0.01）。以上數(shù)據(jù)表明，燕麥青稞粉對小鼠血脂起到一定的改善作用。

2.5 燕麥青稞對糖尿病小鼠抗氧化指標(biāo)的影響

高脂燕麥青稞粉組的GSH-px 水平與高脂組相比，顯著升高（P＜0.05），SOD 的水平顯著升高（P＜0.05），MDA 的水平無顯著的差異（P＞0.05），GSH 的水平無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠FBG 的影響Fig.3 Effect of oat barley powder on FBG in diabetic mice

2.6 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠血清胰島素的影響

與高脂組相比較，高脂燕麥青稞粉組胰島素有極顯著差異（P＜0.01），陽性對照組與高脂組比較無顯著差異（P＞0.05）。高脂組與空白對照組比較，有極顯著差異（P＜0.01）。

圖4 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠血清胰島素的影響Fig.4 Effect of oat barley powder on serum insulin in diabetic mice

表1 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠血脂的影響Table 1 Effects of oat barley powder on blood lipids in diabetic mice

表2 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of oat barley powder on oxidation index in diabetic mice

2.7 小鼠胰島HE 染色切片

如圖5所示，（圖中病理切片放大倍數(shù)均為20x）空白對照組組織染色均勻，腺泡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胰島形狀規(guī)則，未見明顯炎癥?？瞻籽帑溄M組織染色均勻，腺泡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胰島形狀規(guī)則，未見明顯炎癥。高脂組組織染色均勻，腺泡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；胰島數(shù)量大量減少、面積減小，局部僅存胰島中可見胰島細(xì)胞胞質(zhì)空泡化；局部淋巴管中可見淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。高脂燕麥組組織染色均勻，腺泡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；胰島數(shù)量大量減少、面積減小，局部僅存胰島中可見分裂象。陽性對照組組織染色均勻，腺泡細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胰島形狀規(guī)則，未見明顯炎癥。整體表明，燕麥青稞粉能部分改善小鼠胰腺組織的病理狀態(tài)。

圖5 胰島HE 染色切片F(xiàn)ig.5 HE-stained sections of pancreatic islets

2.8 燕麥青稞粉對腸道菌群的影響

從圖6結(jié)果整體來看，各組整體菌群豐度有很大不同，其中乳酸菌（Lactobacillus，圖中紅色）菌群在幾組間變化是非常明顯的。正常組中乳酸菌含量最高，極為明顯，模型組中乳酸菌含量降低至幾乎沒有，高脂燕麥青稞粉組乳酸菌含量比高脂模型組的有一定程度的增加，陽性對照組的乳酸菌含量明顯高于吃高脂燕麥青稞粉的組，說明燕麥青稞，在腸道菌群的改變中起到一定的作用，從而在一定程度上起到調(diào)節(jié)血糖的作用。

圖6 燕麥青稞粉對糖尿病小鼠腸道菌群的影響Fig.6 The effect of oat barley powder on the intestinal flora of diabetic mice

3 討論

并發(fā)癥的產(chǎn)生是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病患者胰島素生物學(xué)調(diào)節(jié)障礙，在血糖水平升高時往往伴隨著脂代謝異常，糖尿病和高脂血癥更可能引起中風(fēng)，冠狀動脈疾病和肢體壞死等并發(fā)癥，因此調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂十分重要[20-23]。通過研究數(shù)據(jù)表明，燕麥青稞粉可以降低II 型糖尿病小鼠的高血脂情況，說明其在降血脂方面有較好的活性，在預(yù)防與治療糖尿病方面有較好的應(yīng)用價值[24-27]。II 型糖尿病的發(fā)生與機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，在糖尿病大鼠體內(nèi)，氧化應(yīng)激水平升高[20]。本研究結(jié)果顯示，燕麥青稞粉對II 型糖尿病小鼠模型具有降低血糖的作用。與高脂組相比，SOD 水平和GSH-Px 活力顯著升高，說明燕麥青稞粉起到了一定的抗氧化作用。HDL-c 和LDL-c 水平都發(fā)生降低，LDL-c 水平的降低將對糖尿病起到緩解作用，兩者水平的同時降低，可能與脂代謝紊亂有關(guān)，也可能是燕麥青稞粉只起到一定的調(diào)節(jié)作用，并不能對其產(chǎn)生治療的功效。

腸道菌群參與并影響著人體的物質(zhì)與能量代謝[28]。乳酸菌對糖脂代謝紊亂恢復(fù)和腸道菌群營養(yǎng)不良的恢復(fù)的影響表現(xiàn)出種內(nèi)和種內(nèi)差異[29]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可以通過調(diào)節(jié)脂代謝、糖代謝等對糖尿病產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[30]。對小鼠的腸道菌群種類進(jìn)行了檢測，乳酸菌在不同組中差異較大，對糖脂代謝可能具有一定的作用，具體的作用方式仍不清楚，可進(jìn)行進(jìn)一步探究。一些未知菌群在各組變化也十分明顯，但是并不知道具體是什么種類，以及對血糖的調(diào)節(jié)起到何種作用，對此值得進(jìn)一步深入研究。燕麥青稞粉可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群來實現(xiàn)降血糖的作用。