甘蔗黃蚜室內(nèi)人工飼養(yǎng)繁殖體系的建立

傅華英+黃美婷+高三基+王錦達(dá)

摘 要：甘蔗黃蚜（Longiunguis sacchari Zehntner）是多種甘蔗病毒病的傳播蟲媒，建立甘蔗黃蚜室內(nèi)人工飼養(yǎng)體系，可以為開展甘蔗黃蚜的抗藥性及甘蔗品種抗性的鑒定提供均一性的蟲源。該研究篩選甘蔗黃蚜不同的消毒時(shí)間和不同的接種方式，經(jīng)過人工飼養(yǎng)條件的優(yōu)化，建立了一個(gè)穩(wěn)定、快速、高效的人工飼養(yǎng)繁殖體系。田間采集帶有甘蔗黃蚜的甘蔗葉片，經(jīng)0.1 %HgCl2消毒4～10min，然后接種于無菌甘蔗組培瓶苗中，在（22±1）℃、光照強(qiáng)度3000lx、光照時(shí)長(zhǎng)10～12h條件下培養(yǎng)，每隔10～12d轉(zhuǎn)接1次，即可經(jīng)年持續(xù)繁殖無菌、均一性好的甘蔗黃蚜。

關(guān)鍵詞：甘蔗；甘蔗黃蚜；人工飼養(yǎng)

中圖分類號(hào) S435.661；Q969.93 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）22-0039-03

Abstract：Longiunguis sacchari Zehntner is the insect vector of several viral diseases. The artificial propagation can provide the homogeneous source of the Longiunguis sacchari Zehntner for insect resistance to pesticides and sugarcane resistance to diseases. A stable， rapid and efficient artificial propagation is established through optimizing the different sterilization time， inoculation methods， and artificial breeding conditions. Sugarcane leaves with Longiunguis sacchari Zehntner from field were sterilized with 0.1% HgCl2 for 4～10 min， and then were transferred into the aseptic seedlings in a container. Subsequently， these aseptic seedlings are cultivated under the light intensity of 3000 lx with a light （10～12 h）/dark （12～14 h） photoperiod at 22±1 ℃. All the materials will be subcultured every 10～12 days.

Key words：Sugarcane；Longiunguis sacchari Zehntner；Artificial propagation

甘蔗（Saccharum spp. Hybrids）是我國(guó)重要的糖料作物，主要在廣西、云南、廣東、海南等?。▍^(qū)）種植，產(chǎn)糖量占中國(guó)食糖總產(chǎn)量的90%以上[1-3]。甘蔗蚜蟲是甘蔗生產(chǎn)的主要害蟲之一，在我國(guó)各蔗區(qū)普遍發(fā)生且為害嚴(yán)重，它既影響甘蔗產(chǎn)量，又影響蔗糖含量及品質(zhì)，對(duì)蔗農(nóng)和糖廠的經(jīng)濟(jì)效益影響都很大，據(jù)報(bào)道受害的蔗田通常減產(chǎn)5%～10%，嚴(yán)重的達(dá)30%～40%[4-5]。

甘蔗蚜蟲可分為綿蚜（Ceratovacuna Lanigera Zehntner）、刺根蚜（Tetrancura birsuta Baker）和黃蚜（又名高梁蚜）（Longiunguis sacchari Zehntner）3種，均為同翅目蚜蟲科昆蟲[4-5]。其中甘蔗黃蚜可分有翅型和無翅型2種，有翅型成蟲體長(zhǎng)1.5mm，翅膀長(zhǎng)為2mm，翅膀呈透明，翅脈為深褐色，沿著翅脈的部位有暗色斑。無翅型成蟲體長(zhǎng)1.5～2mm，淡黃至淡綠色。甘蔗黃蚜不僅危害甘蔗，而且會(huì)危害高粱、玉米、黍等禾本科作物，在廣東、福建、江西、云南和臺(tái)灣等偶有發(fā)生[5]。甘蔗黃蚜以成、若蚜群集甘蔗葉片葉背面和莖部刺吸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，由底部葉片向上蔓延取食，使蔗葉枯黃凋萎，同時(shí)分泌出的大量蜜露，亦可誘發(fā)煤煙病，有時(shí)滴落在葉面或莖上，油亮發(fā)光，影響光合作用和新陳代謝，致葉色變紅，莖稈酥軟早枯或彎倒，影響生長(zhǎng)和含糖量，造成產(chǎn)量降低，糖質(zhì)變劣，留作宿根的發(fā)株差，作種蔗的萌芽率降低[4-6]。同時(shí)，甘蔗黃蚜還是甘蔗黃葉病毒、甘蔗花葉病毒、高梁花葉病毒的傳播媒介[7]。

目前，甘蔗黃蚜作為病毒傳播媒介和抗藥性試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)材料，所用蟲源一般直接采自田間寄主植株[8，9]，需要花費(fèi)大量人力物力，并且在自然環(huán)境下，甘蔗黃蚜的生長(zhǎng)繁殖受季節(jié)和環(huán)境條件影響，不能保證有足夠的實(shí)驗(yàn)材料，且均一性較差。因此，急需解決甘蔗黃蚜室內(nèi)人工飼養(yǎng)繁殖技術(shù)問題，建立簡(jiǎn)單易行、快速大量繁殖技術(shù)體系，為甘蔗抗病蟲育種及防治甘蔗黃蚜的新型農(nóng)藥的研發(fā)提供可靠的、均一性好、不受季節(jié)限制的蟲源實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試無菌甘蔗組培瓶苗 供試甘蔗無菌組培瓶苗高于2cm，由甘蔗品種福農(nóng)1110和福農(nóng)38號(hào)的愈傷組織分化而來，由國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 供試蚜蟲 供試蚜蟲為甘蔗黃蚜，2016年7月采集于國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心的白沙實(shí)驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 消毒時(shí)間試驗(yàn) 采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，觀察不同消毒時(shí)間即30s、2min、3min、4min、5min、10min和20min對(duì)甘蔗黃蚜的影響。將含有甘蔗黃蚜的蔗葉剪成3cm長(zhǎng)的短段，放入無菌廣口瓶中，倒入0.1%升汞直至浸沒葉片，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間消毒，消毒時(shí)間一結(jié)束，取出葉片，用無菌水沖洗3遍后用無菌紙片吸干表面水分，把甘蔗葉片剪成含有一只甘蔗黃蚜的小葉片，把小葉片接入無菌瓶苗中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種一片含一只甘蔗黃蚜的小葉片，3個(gè)重復(fù)。將其放置于（22±1）℃、光照時(shí)間10～12h/d、光照強(qiáng)度3000lx的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，10d后觀察并記錄污染瓶數(shù)和成活瓶數(shù)，計(jì)算污染率，計(jì)算公式為：endprint

污染率（%）=污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100

1.2.2 接種方式試驗(yàn) 本試驗(yàn)探討了以下2種接種方式對(duì)甘蔗黃蚜飼養(yǎng)體系的影響。方式一是用沾上無菌水的鑷子沾上消毒后的甘蔗葉片上的甘蔗黃蚜，直接將黃蚜接種于無菌瓶苗中；方式二是把已消毒的含甘蔗黃蚜的葉片接種于無菌瓶苗，48h內(nèi)待甘蔗黃蚜遷移到無菌瓶苗時(shí)把葉片及時(shí)取出。將含有甘蔗黃蚜的蔗葉剪成3cm長(zhǎng)的短段，放入無菌廣口瓶中，倒入0.1%升汞直至浸沒葉片，消毒5min，消毒時(shí)間一結(jié)束，取出葉片，用無菌水沖洗3遍，放置于無菌紙片上吸干多余水分。按照上述不同的接種方式分別將甘蔗黃蚜接種于無菌瓶苗種，每個(gè)處理接種10瓶，3次重復(fù)。放置于（22±1）℃、光照時(shí)間10～12h/d、光照強(qiáng)度3000Lx的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，10d后觀察并記錄污染瓶數(shù)和成活瓶數(shù)，計(jì)算污染率和成活率，計(jì)算公式如下：

污染率（%）=污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100；

成活率（%）=不污染且蚜蟲為活的瓶數(shù)/（接種瓶數(shù)-污染瓶數(shù)）×100

1.2.3 甘蔗黃蚜用無菌瓶苗培養(yǎng)的繁殖試驗(yàn) 從田間采集含有甘蔗黃蚜的甘蔗葉片，將其剪成含1只大小約1mm甘蔗黃蚜的小葉片接種于甘蔗葉片上，每瓶接種1只，接種15瓶，2個(gè)重復(fù)。放置于（22±1）℃、光照時(shí)間10～12h/d、光照強(qiáng)度3000lx的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，每2d觀察并統(tǒng)計(jì)活的蚜蟲數(shù)和死亡蚜蟲數(shù)，觀察統(tǒng)計(jì)的同時(shí)放入新鮮的葉片，取出枯死不含蚜蟲的葉片，觀察6次后計(jì)算蚜蟲繁殖倍數(shù)、死亡率、成活率。挑取經(jīng)瓶苗中培養(yǎng)了2個(gè)月以上的大小約1mm甘蔗黃蚜按每瓶1只接種于無菌瓶苗中，接種15瓶，3次重復(fù)。放置于（22±1）℃、光照時(shí)間10～12h/d、光照強(qiáng)度3000Lx的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，每2d觀察并統(tǒng)計(jì)活的蚜蟲數(shù)和死亡蚜蟲數(shù)，觀察6次后計(jì)算蚜蟲的繁殖倍數(shù)、死亡率、成活率，計(jì)算公式如下：

繁殖倍數(shù)=總蚜蟲數(shù)/接種蚜蟲數(shù)；

成活率（%）=成活蚜蟲數(shù)/總蚜蟲數(shù)×100；

死亡率（%）=死亡蚜蟲數(shù)/總蚜蟲數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗黃蚜不同消毒時(shí)間的消毒效果 從表1可以看出，用0.1%升汞消毒，時(shí)間少于4min時(shí)消毒效果不理想：30s時(shí)污染率100.00%，無消毒效果；2min的污染率為86.67%；3min時(shí)下降到46.67%，其污染率皆超過40%。消毒時(shí)間超過4min后消毒效果超過80.00%，并隨著消毒時(shí)間的增加，甘蔗黃蚜接種的污染率呈下降趨勢(shì)，不過污染率下降并不明顯，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)消毒時(shí)間超過10min后死亡率增加，這也許是升汞對(duì)蚜蟲也有傷害。因而消毒時(shí)間以4～10min為宜。

2.2 甘蔗黃蚜不同接種方式的污染率和成活率 從圖1可以看出，在相同的消毒方法下，2種不同接種方式，其污染率非常接近，方式一即用鑷子沾單只蚜蟲接種無菌苗的污染率略低于方式二即用含有蚜蟲的葉片接種無菌苗的污染率；然而蚜蟲成活率差距卻很大，前一種方式成活率才29.29%，而后一種方式的成活率達(dá)100.00%，因而以采用后一種接種方式為佳。

2.3 甘蔗黃蚜在無菌甘蔗瓶苗培養(yǎng)的繁殖倍數(shù) 對(duì)比了用無菌甘蔗瓶苗飼養(yǎng)和用甘蔗葉片飼養(yǎng)的繁殖倍數(shù)、死亡率、成活率。從表2可以看出，無菌甘蔗瓶苗飼養(yǎng)與甘蔗葉片飼養(yǎng)在6d之前繁殖倍數(shù)、死亡率、成活率差異不大，用無菌甘蔗瓶苗飼養(yǎng)的蚜蟲繁殖速度略高于以甘蔗葉片為飼養(yǎng)介質(zhì)的蚜蟲。6d后差異漸漸加大，用無菌甘蔗瓶苗飼養(yǎng)的蚜蟲繁殖速度漸漸低于以甘蔗葉片為飼養(yǎng)介質(zhì)的蚜蟲，前者的死亡率增加，后者幾乎沒有死亡；同時(shí)觀察到無菌甘蔗瓶苗開始停止生長(zhǎng)開始枯黃死亡，因而這可能是無菌甘蔗瓶苗不夠蚜蟲生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要而導(dǎo)致甘蔗黃蚜的死亡和繁殖速率下降。由此可見，用無菌甘蔗瓶苗作飼養(yǎng)介質(zhì)來飼養(yǎng)甘蔗黃蚜是可行的，并且為了保持甘蔗黃蚜生長(zhǎng)持續(xù)良好，7d左右需要轉(zhuǎn)入新鮮的無菌瓶苗中。用無菌甘蔗瓶苗飼養(yǎng)甘蔗黃蚜至12d時(shí)，繁殖倍數(shù)還高達(dá)58倍，死亡率為14.30%，繁殖率高死亡率低，對(duì)其繼續(xù)培養(yǎng)至20d，發(fā)現(xiàn)死亡率持續(xù)上升，繁殖量增加不明顯，培養(yǎng)至20d死亡率超過70%，甘蔗瓶苗也枯黃死亡。

3 討論與小結(jié)

3.1 討論 本研究選用了0.1%升汞作為消毒劑對(duì)甘蔗黃蚜進(jìn)行消毒，消毒效果顯著且在一定消毒時(shí)間內(nèi)不影響甘蔗黃蚜正常生長(zhǎng)。其他消毒劑是否也有類似的消毒效果而不影響蚜蟲和無菌苗的生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步研究。在甘蔗黃蚜不同接種方式的試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)甘蔗黃蚜接種于無菌瓶苗后出現(xiàn)少量的死亡現(xiàn)象，這可能是因?yàn)檠料x是刺吸式口器，在用鑷子沾取的過程中有弄斷它的口器，導(dǎo)致它無法吸食而餓死。甘蔗黃蚜在室內(nèi)人工飼養(yǎng)繁殖的過程中，隨著人工飼養(yǎng)繁殖的時(shí)間延長(zhǎng)，甘蔗黃蚜種群數(shù)量也逐漸增加，當(dāng)人工飼養(yǎng)繁殖8d之后，甘蔗黃蚜種群數(shù)量急劇擴(kuò)增，這時(shí)由于甘蔗黃蚜群體數(shù)量過大，也會(huì)一些甘蔗黃蚜個(gè)體出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。因此，建議人工飼養(yǎng)繁殖10～12d時(shí)要繼續(xù)傳代繁殖，或者選取均一性好的甘蔗黃蚜作為傳毒實(shí)驗(yàn)或抗藥性等實(shí)驗(yàn)的蟲源。

3.2 結(jié)論 通過對(duì)消毒時(shí)間和接種方式的優(yōu)化，建立了一個(gè)可持續(xù)、穩(wěn)定的甘蔗黃蚜人工飼養(yǎng)繁殖技術(shù)體系。該技術(shù)體系為田間采集帶甘蔗黃蚜的甘蔗葉片，經(jīng)0.1%HgCl2消毒4～10min，把有甘蔗黃蚜的甘蔗葉片接種于無菌瓶苗中，在（22±1）℃每天光照強(qiáng)度3000lx、光照時(shí)長(zhǎng)10～12h條件下培養(yǎng)，每10d取不污染成活的含甘蔗黃蚜的瓶苗轉(zhuǎn)接即可經(jīng)年持續(xù)繁殖甘蔗黃蚜。此人工飼養(yǎng)體系，沒有季節(jié)的依賴性，可以全年進(jìn)行甘蔗黃蚜的快速和大量繁殖，為甘蔗抗蟲育種、研制防治蚜蟲新型農(nóng)藥等方面的研究提供足夠的實(shí)驗(yàn)材料，確保研究者能夠快速、持續(xù)地開展工作。

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（責(zé)編：張宏民）endprint