球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株與初始菌株生物學(xué)特性比較

謝翎

摘 要：該文對(duì)SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)的球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株與原始出發(fā)菌株各自在菌落形態(tài)，菌絲生長(zhǎng)速度，產(chǎn)孢量等方面進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株與原始出發(fā)菌株的菌落形態(tài)有一定差異。且球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株菌絲生長(zhǎng)速度更快，其菌絲生長(zhǎng)速度為（3.73±0.05）㎜/d而原發(fā)菌株菌絲生長(zhǎng)速度為（3.45±0.52）㎜/d。另外，重組菌株的產(chǎn)孢量（0.92±0.02）×108個(gè)，明顯低于原始出發(fā)菌株（1.12±0.17）×108個(gè)。

關(guān)鍵詞：球孢白僵菌；生物學(xué)特性；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào) Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）22-0034-02

Abstract：The biological characteristics of Beauveria bassiana tps1 recombination strain and its origin strain were evaluated based on colonial form， rate of colony growth and spore-bearing yield. The results showed that the colonial forms of these two strains are similar. Moreover， the recombination strain （3.73±0.05 ㎜/d） grow faster than the origin strain（3.45±0.52㎜/d）. And the spore-bearing yield of the recombination strains was （0.92±0.02）×108 ，while the spore-bearing yield of the origin strain was（1.12±0.17）×108.

Key words：Beauveria bassiana；Biological characteristics；Transgene

1 引言

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是國(guó)內(nèi)外廣泛用于害蟲生物防治的殺蟲真菌之一，被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的一種昆蟲病原真菌。通過基因改造其環(huán)境適應(yīng)性，是進(jìn)一步擴(kuò)大球孢白僵菌殺蟲劑應(yīng)用的有效手段。我們前期工作中利用含有構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBARGPE1對(duì)球孢白僵菌Bb202菌株的海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1進(jìn)行了組成型超量表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)tps1轉(zhuǎn)基因重組菌株與其原始出發(fā)菌株在生物學(xué)特性以及產(chǎn)孢率進(jìn)行了檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 菌株來源 供試的白僵菌Bb202菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，其寄主為松褐天牛，采自日本。球孢白僵菌tps1基因，組成型表達(dá)重組菌株，由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

2.2 培養(yǎng)基 SADY固體培養(yǎng)基：葡萄糖4%、酵母浸出粉1%、蛋白胨1%、瓊脂2%。高壓滅菌鍋中滅菌后備用。SDY液體培養(yǎng)基：葡萄糖4%、酵母浸出粉1%、蛋白胨1%。高壓滅菌鍋中滅菌后備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 菌落形態(tài)的觀察 將保存的球孢白僵菌原發(fā)菌株和球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株分別配成1×106孢子/mL濃度的孢懸液，并用微量移液器取3μL點(diǎn)于薩氏培養(yǎng)基SDAY培養(yǎng)基平板正中心，25℃恒溫培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)特征。

2.3.2 菌落生長(zhǎng)速度測(cè)定 按前述方法將球孢白僵菌原發(fā)菌株和球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株分別接種在SDAY斜平板上，置于25℃恒溫培養(yǎng)。每48h，定時(shí)用精密卡尺檢測(cè)菌落直徑并記錄、分析比較各菌株的菌落生長(zhǎng)速度，共記錄10d。

2.3.3 產(chǎn)孢量測(cè)定 將上述方法培養(yǎng)12d的樣本用于產(chǎn)孢量的測(cè)定。即在菌株培養(yǎng)到第12天的平板上，用直徑為5㎜的打孔器在菌落中央到邊緣的中點(diǎn)處取出一定面積的菌落塊，放入試管中，再加入適量的吐溫-80和無菌水，加上棉塞，置于搖床上搖一夜，使分生孢子充分搖散，制成孢子懸液。然后用膠頭滴管取一滴混勻的孢子懸液，滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，測(cè)定孢子量。每種菌株重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)每種菌株的產(chǎn)孢量，比較球孢白僵菌原發(fā)菌株與球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株在SDAY平板培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量。計(jì)算公式如下：

1㎝2菌落含孢量=（平均每小格孢子數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù)）/打孔面積

3 結(jié)果與分析

3.1 菌落形態(tài)比較 在SDAY培養(yǎng)基上，分別對(duì)球孢白僵菌原發(fā)菌株和球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種菌株的菌落外觀初期菌落形態(tài)及色澤無差異，但產(chǎn)孢后孢子色澤不同。生長(zhǎng)后期，菌落表面凹凸形態(tài)及放射溝也有差別（表1、圖1）。

3.2 菌落生長(zhǎng)速度比較 由表2可知，2種菌株在SDAY培養(yǎng)基上營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量存在差異。10d內(nèi)菌落平均生長(zhǎng)直徑在34.5～37.3mm。從總體上來看，球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株的菌落生長(zhǎng)速度較快，其菌落平均生長(zhǎng)速度達(dá)（3.73±0.05）mm/d，而原發(fā)菌株的菌落平均生長(zhǎng)速度為（3.45±0.52）mm/d。分析同時(shí)表明在生長(zhǎng)初期，轉(zhuǎn)基因菌株的菌落生長(zhǎng)速度較快，而到生長(zhǎng)后期，2種菌株的菌落生長(zhǎng)速度差別不大。

4 討論

TPS在海藻糖合成的第一步中起作用，催化UDP葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸。將tps1基因?qū)肭蜴甙捉┚心苁顾e累海藻糖，海藻糖不僅是一種可存儲(chǔ)的糖類物質(zhì)，而且是一種重要的脅迫保護(hù)劑，因此可以提高球孢白僵菌在脅迫環(huán)境中的抗逆性。

為評(píng)價(jià)球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株生物學(xué)特性，本文通過菌落形態(tài)、菌落生長(zhǎng)速度（營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量）、產(chǎn)孢量等指標(biāo)，以反映轉(zhuǎn)基因后菌株性狀變化。前期研究表明，球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株在脅迫環(huán)境中，抗逆性明顯增強(qiáng)。而在產(chǎn)孢量與菌落生長(zhǎng)速度的變化，也會(huì)對(duì)球孢白僵菌的生產(chǎn)應(yīng)用造成影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株的菌落生長(zhǎng)速度略快于初始菌株，但其產(chǎn)孢量明顯下降。這表明tps1的基因改造加快了菌體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)（菌絲生長(zhǎng)），但其生殖生長(zhǎng)（產(chǎn)孢）卻受到了一定抑制。

參考文獻(xiàn)

[1]Viaud M，Couteaudier Y，Levis C，et al.Genome organization in Beauveria bassiana：electrophoretic karyotype， gene mapping， and tolomeric fingerprint[J].Fungal Genetics and Biology，1996，20（3）：175-183.

[2]Viaud M， Couteaudier Y， Riba G. Molecular analysis of hypervirulent somatic hybrids of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Beauveria sulfurescens[J]. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（1）：88-93.

[3]丁珊，孫繼梅，肖華，等.篩選球孢白僵菌菌株的實(shí)驗(yàn)[J]. 森林病蟲通訊，1997，3：13-16.

[4]樊美珍，李增智，王成樹，等.感染球孢白僵菌的馬尾松毛蟲僵蟲產(chǎn)孢量的測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，23（3）：392-396.

[6]錄麗平，孫常德，楊美林，等.石斛象甲蠟蚧輪枝菌6菌株生物學(xué)特性及對(duì)煙蚜致病性的比較[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21 （6）：94-96.

[6]韓建榮，李智偉，王宇，等.一株產(chǎn)菌核青霉的生物學(xué)特性研究[J].山西大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（4）：634-639.

[7]王大紅，郭文杰，陶文沂.粘細(xì)菌WXNXJ-B生物學(xué)特性及生長(zhǎng)條件研究[J].生物技術(shù)，2009，19（3）：27-30.

（責(zé)編：張宏民）endprint