大孔吸附樹脂分離純化2′-脫氧腺苷

吳 明 杰， 杜 杰， 崔 勵(lì)

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化工學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

大孔吸附樹脂分離純化2′-脫氧腺苷

吳 明 杰， 杜 杰， 崔 勵(lì)

( 大連工業(yè)大學(xué) 輕工與化工學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

主要研究了大孔吸附樹脂分離純化生物轉(zhuǎn)化液中的2′-脫氧腺苷的工藝條件。通過靜態(tài)吸附法考察了7種不同類型樹脂的吸附能力，最適吸附樹脂為D101，最佳吸附pH 8.0，確定了先用0.1 mol/L Na2CO3洗脫再用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫的洗脫工藝。通過動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)確定了大孔吸附樹脂分離純化2′-脫氧腺苷的最佳工藝條件：上樣體積流量2.0 mL/min，洗脫體積流量1.5 mL/min，洗脫劑依次為4.5倍柱體積的0.1 mol/L Na2CO3溶液、3倍柱體積的體積分?jǐn)?shù)30%乙醇。在該條件下，質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.7% 的2′-脫氧腺苷收率為93.9%。

脫氧腺苷；大孔吸附樹脂；純化

0 引 言

2′-脫氧腺苷是一種天然脫氧核苷，既是生化藥物和基因工程研究的重要原材料,又是生產(chǎn)抗腫瘤和抗病毒核苷類藥物的重要中間體，因此在市場(chǎng)上有廣泛需求[1-2]。2′-脫氧腺苷可通過脫氧核糖核酸降解得到,但是由于DNA供應(yīng)的不穩(wěn)定,以及降解后產(chǎn)物復(fù)雜、分離困難等原因，該方法并不實(shí)用。脫氧腺苷也可通過化學(xué)合成法合成,但需要將一些基團(tuán)保護(hù)與去保護(hù)以及糖基的活化反應(yīng)，步驟復(fù)雜，且得到的是一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體，需要拆分等[3-4]。

以2′-脫氧胸苷為核糖基供體，腺嘌呤為堿基供體通過生物轉(zhuǎn)化法制備2′-脫氧腺苷,只需要一步反應(yīng)，避免了傳統(tǒng)化學(xué)法的不足。其反應(yīng)機(jī)理已有報(bào)道[5]。如何從成分復(fù)雜的發(fā)酵液中分離純化出活性物質(zhì)，繼而對(duì)微生物藥物實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，非常重要[6-7]。大孔吸附樹脂是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較好的吸附性能，在分離純化苷、黃酮、皂苷、生物堿等成分方面已得到逐步應(yīng)用，為吸附法提取微生物藥物提供了新的途徑[8-9]。本研究采用大孔吸附樹脂法分離純化生物轉(zhuǎn)化液中的2′-脫氧腺苷，確定了分離純化工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材 料

試劑：標(biāo)準(zhǔn)品2′-脫氧腺苷(dA)、胸腺嘧啶(T)、甲醇，色譜純；其他試劑均為分析純；生物轉(zhuǎn)化液自制。

儀器：島津高效液相色譜儀，UV檢測(cè)器(SPD-10A)，C18反相柱(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；pH計(jì)；離心機(jī)；真空抽濾泵；搖床；分析天平等。

1.2 方 法

1.2.1 生物轉(zhuǎn)化液的制備及預(yù)處理

生物轉(zhuǎn)化液的制備：60 mmol/L的脫氧胸苷(dT)，60 mmol/L的腺嘌呤(A)，6%的濕菌體，磷酸鹽緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物，在55 ℃下120 r/min振蕩反應(yīng)2 h，摩爾轉(zhuǎn)化率約65%。其中底物腺嘌呤、副產(chǎn)物胸腺嘧啶為主要雜質(zhì)，濃度分別約為20、15 mmol/L[10]。

預(yù)處理：將得到的生物轉(zhuǎn)化液離心除去菌體,取上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)方法

用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。液相色譜操作條件：5 mmol/L磷酸鹽緩沖液-甲醇(體積比85∶15)為流動(dòng)相，體積流量為0.8 mL/min，吸收波長(zhǎng)為254 nm，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定2′-脫氧胸苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤的濃度。

2′-脫氧腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.035 7x，R2=0.999 6。x為dA峰面積，10-3；y為dA質(zhì)量濃度，mg/L。

胸腺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.063 2x，R2=0.999 1。x為T峰面積，10-3；y為T質(zhì)量濃度，mg/L。

腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.059 1x，R2=0.999 3。x為A峰面積，10-3；y為A質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.3 樹脂預(yù)處理

將7種樹脂(717、D201、D290、HPD600、DM130、AB-8、D101)先用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇充分浸泡24 h，經(jīng)檢測(cè)無有機(jī)性物質(zhì)后用去離子水洗至無醇味，在1 mol/L NaOH溶液中浸泡4 h，去離子水洗至中性，在1 mol/L HCl中浸泡4 h，去離子水洗至中性。若為陰離子型樹脂則再在0.1 mol/L NaCl溶液中浸泡4 h，去離子水洗至中性[11]。

1.2.4 靜態(tài)吸附與解吸

準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的樹脂5.0 g(用濾紙吸干)，裝入50 mL三角瓶中，加入11.0 mL預(yù)處理的生物轉(zhuǎn)化液，20 ℃、120 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩吸附15 h，HPLC法測(cè)定生物轉(zhuǎn)化液及殘液中2′-脫氧腺苷、腺嘌呤、胸腺嘧啶的濃度，計(jì)算dA、T、A的吸附率和單位質(zhì)量樹脂的dA吸附量。

吸附率=(ρ0-ρ1)/ρ0

(1)

吸附量=(ρ0-ρ1)V0/m

(2)

式中：ρ0為生物轉(zhuǎn)化液中成分的初始質(zhì)量濃度，mg/L；ρ1為吸附后殘液中成分質(zhì)量濃度，mg/L；V0為生物轉(zhuǎn)化液體積，mL；m為濕樹脂質(zhì)量，g。

將吸附飽和的樹脂濾出，吸干表面水分，加入與原生物轉(zhuǎn)化液相同體積的20%乙醇，20 ℃、120 r/min 振蕩洗脫15 h，充分解吸后，過濾并測(cè)定濾液中dA的濃度，按式(3)計(jì)算dA解吸率。

dA解吸率=ρ2/(ρ0-ρ1)

(3)

式中：ρ2為解吸液中dA的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.2.5 洗脫劑的選擇

用原生物轉(zhuǎn)化液2倍體積的洗脫液在20 ℃、120 r/min振蕩洗脫吸附飽和的D101樹脂5 h，收集洗脫液，檢測(cè)各洗脫液中各組分濃度，計(jì)算dA、A、T的解吸率。

1.2.6 動(dòng)態(tài)吸附與解吸

動(dòng)態(tài)吸附：稱取D101樹脂20.0 g，濕法裝柱，將適量生物轉(zhuǎn)化液通過樹脂柱，測(cè)殘液中dA質(zhì)量濃度，以dA吸附量為指標(biāo)考察上樣液的體積、體積流量等因素對(duì)樹脂吸附性能的影響。

動(dòng)態(tài)解吸：將0.1 mol/L Na2CO3水溶液以1.5 mL/min的體積流量通過已吸附飽和的樹脂柱，每10 min檢測(cè)洗脫液成分，待將大部分雜質(zhì)洗脫掉且只有少量產(chǎn)物被洗掉時(shí)，改用30%的乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，考察洗脫劑用量對(duì)樹脂解吸性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附-解吸結(jié)果

2.1.1 吸附樹脂的篩選

由于dA在酸性環(huán)境下易水解，故在選用吸附樹脂時(shí)不考慮陽(yáng)離子樹脂。不同吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果見表1?？梢钥闯?，D101、AB-8 對(duì)dA均有較大的吸附率，但較之D101，AB-8的dA解吸率偏低，故由此確定D101為最適吸附樹脂。D101為國(guó)產(chǎn)樹脂，價(jià)廉易得，適于實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際生產(chǎn)使用。

表1 不同吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

2.1.2 pH對(duì)靜態(tài)吸附的影響

生物轉(zhuǎn)化液的pH對(duì)各成分吸附的影響主要有：堿基及核苷在不同pH的生物轉(zhuǎn)化液中呈現(xiàn)不同的形式；溶液pH的改變可以影響有效成分在溶液中的溶解度；溶液pH變化改變?nèi)芤簶O性, 影響成分和大孔吸附樹脂分子間作用力[12]。樹脂吸附15 h后，不同pH對(duì)dA靜態(tài)吸附的影響結(jié)果見圖2。可以看出，在pH 6～8，樹脂對(duì)dA的吸附率隨著pH的增大而升高，當(dāng)pH為8.0時(shí)，吸附率最大，而后又稍降，因此確定吸附最佳pH為8.0。pH 8.0時(shí)，接近dA在水溶液中的等電點(diǎn)，此時(shí)dA完全處于游離態(tài)，在溶液中的溶解度最小，因此吸附到D101型大孔樹脂上的量最多。

圖1 pH對(duì)吸附效果的影響

2.1.3 洗脫劑對(duì)解吸效果的影響

根據(jù)發(fā)酵液中各成分的性質(zhì)考察不同洗脫劑對(duì)解吸效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2?？梢钥闯觯w積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫時(shí)，對(duì)主要雜質(zhì)A、T和產(chǎn)物dA都有最大的洗脫量，但不能將其分離。0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脫時(shí)，對(duì)A、T均有較大的洗脫量，而對(duì)dA的洗脫量相對(duì)很小，此時(shí)兩者之間的差距最大。確定的洗脫方案：先用0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脫，除去堿基，再用30%的乙醇洗脫得到純度較高的dA。

表2 不同洗脫液對(duì)解吸效果的影響

2.2 大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附結(jié)果

2.2.1 D101型大孔吸附樹脂對(duì)dA的動(dòng)態(tài)吸附曲線

由圖2可以看出，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)，基本達(dá)到吸附平衡，平衡時(shí)間短，這與其吸附機(jī)理有關(guān)。較短的平衡時(shí)間為樹脂的工業(yè)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

圖2 D101型大孔吸附樹脂對(duì)dA的動(dòng)態(tài)吸附曲線

2.2.2 上樣液體積流量對(duì)吸附效果的影響

將等量的生物轉(zhuǎn)化液以不同的體積流量通過D101型大孔吸附樹脂柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，考察不同上樣液體積流量對(duì)吸附效果的影響。由圖3可知，隨著上樣體積流量的增大，樹脂的吸附量降低，不利于吸附的進(jìn)行，但上樣速度太慢，會(huì)延長(zhǎng)吸附所需時(shí)間?？紤]到吸附效果和工作效率，選擇上樣體積流量為2.0 mL/min。

圖3 上樣體積流量對(duì)dA吸附的影響

2.2.3 洗脫劑用量的選擇

先用0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脫，除去大部分堿基A、T，再用30%的乙醇洗脫，洗脫液用量見表3。由表3可以看出，用4.5倍柱體積的0.1 mol/L Na2CO3溶液洗脫劑、3倍柱體積30%乙醇洗脫劑即可基本將堿基和dA從樹脂上解吸下來，將洗脫液收集后用高效液相色譜法進(jìn)行分析，得到經(jīng)過大孔樹脂分離純化后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.7%的2′-脫氧腺苷，收率為93.9%。

表3 洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響

3 結(jié) 論

利用靜態(tài)吸附法,考查了7種不同類型的樹脂對(duì)2′-脫氧腺苷的吸附、解吸情況。結(jié)果表明，大孔吸附樹脂D101對(duì)dA的吸附、解析能力最強(qiáng)。通過不同洗脫劑的解吸實(shí)驗(yàn)得到洗脫方案：先用0.1 mol/L Na2CO3水溶液洗去大量雜質(zhì)堿基，再用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫。

通過動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定了D101型大孔吸附樹脂分離純化2′-脫氧腺苷的最佳工藝條件：上樣體積流量為2.0 mL/min，洗脫劑依次為4.5倍體積 0.1 mol/L的Na2CO3水溶液、3倍體積30%乙醇，體積流量1.5 mL/min，可得到dA 78.7% 的溶液，收率93.9%。

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Separationandpurificationof2′-deoxyadenosinebymacroporousadsorptionresin

WUMingjie,DUJie,CUILi

(SchoolofLightIndustryandChemicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

The technique of separation and purification of 2′-deoxyadenosine by macroporous adsorption resin was systematically investigated. The adsorption capacity of seven different kinds of resins were studied based on the static adsorption. The results showed that D101 resin was the optimal sorbent and the procedure of desorption were sequential filtration with 0.1 mol/L Na2CO3solution and 30% ethanol at pH 8.0. The optimum operating parameters were determined by dynamic adsorption as follows： sample flow rate of 2.0 mL/min, elution flow rate of 1.5 mL/min, eluting with 4.5 times column volume of 0.1 mol/L Na2CO3, 3 times column volume of 30% ethanol orderly. Under the condition, the content of 2-deoxyadenosine is as high as 78.7%, and the yield could reach to 93.9%.

deoxyadenosine; macroporous adsorption resin; purification

吳明杰,杜杰,崔勵(lì).大孔吸附樹脂分離純化2′-脫氧腺苷[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(6):432-435.

WU Mingjie, DU Jie, CUI Li. Separation and purification of 2′-deoxyadenosine by macroporous adsorption resin[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 432-435.

2016-03-18.

吳明杰(1989-)，男，碩士研究生；通信作者：崔 勵(lì)(1964-)，女，教授.

TQ464.6

A

1674-1404(2017)06-0432-04