維生素D 與COPD患者下呼吸道細(xì)菌定植及痰相關(guān)炎癥因子關(guān)系的研究

王慎臨，楊 朝，張麗萍

·論 著·

維生素D與COPD患者下呼吸道細(xì)菌定植及痰相關(guān)炎癥因子關(guān)系的研究

王慎臨，楊 朝，張麗萍

目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)穩(wěn)定期患者維生素D缺乏與下呼吸道細(xì)菌定植及痰相關(guān)炎癥因子的相關(guān)性。方法篩選COPD穩(wěn)定期患者96例，抽靜脈血采用電化學(xué)方法測定血清25羥基維生素D水平，留取深部痰液進(jìn)行細(xì)菌定量培養(yǎng)(分為定植組和無定植組)，醇聯(lián)免疫吸附法(ELSA)測定痰液上清液中白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，分析2組患者血清25羥基維生素D水平及痰液上清中IL-8、TNF-α水平的差異及相關(guān)性。結(jié)果96例COPD穩(wěn)定期患者存在下呼吸道細(xì)菌定植者有37例，占38.54%。定植組患者血清25羥基維生素D水平明顯低于無定植組，定植組患者痰液上清中IL-8、TNF-α水平明顯高于無定植組(P<0.05)。2組患者血清25羥基維生素D水平與痰液上清中IL-8、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論COPD穩(wěn)定期患者維生素D缺乏容易出現(xiàn)下呼吸道細(xì)菌定植，維生素D水平與IL-8、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)。

慢性阻塞性肺疾病;25羥基維生素D;細(xì)菌定植;白介素-8;腫瘤壞死因子-α

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種氣流受限、不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展的疾病，是最常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，居當(dāng)前死亡原因第四位，每年因高碳酸血癥惡化住院的患者院內(nèi)死亡率約為10%，社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)重。有研究證實，50%的COPD急性發(fā)作是由細(xì)菌引起的[1]，常見的細(xì)菌有流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌等。COPD穩(wěn)定期下呼吸道細(xì)菌的定植與氣道炎癥、頻緊的癥狀發(fā)作和急性加重風(fēng)險有關(guān)[2]。另一項研究顯示與無定植COPD患者相比，流感嗜血桿菌定植的COPD穩(wěn)定期患者，存在更多的氣道炎癥反應(yīng)[3]。針對細(xì)菌定植的情況，仍需要避免長期使用抗生素治療，因為會導(dǎo)致定植菌株的多重耐藥。維生素D有免疫調(diào)節(jié)作用，研究顯示25羥基維生素D水平缺乏與呼吸道感染、住院肺炎患者死亡率相關(guān)[4-5]。那么，維生素D缺乏是不是COPD穩(wěn)定期患者細(xì)菌定植的危險因素呢？維生素D與COPD穩(wěn)定期患者痰炎性因子的相關(guān)性研究國內(nèi)尚未報道。本研究通過比較COPD穩(wěn)定期患者細(xì)菌定植組和無定植組血清25羥基維生素D水平的差異，以及研究血清25羥基維生素D與痰炎性因子白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的相關(guān)性，探討維生素D缺乏與COPD穩(wěn)定期患者細(xì)菌定植的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2015年10月-2016年3月在寧夏人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診就診的慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者96例，其中男性57例，女性39例，平均年齡(65±14.7)歲，均符合納入標(biāo)準(zhǔn)，簽署受試者知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GOLD(2007版)慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。②既往6周無急性加重癥狀，無普通感冒及其他呼吸道感染性疾病。③近4周未使用抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除影響維生素D水平的疾病：支氣管哮喘、肺結(jié)核、腫瘤、糖尿病、甲狀腺疾病、免疫系統(tǒng)疾病。②近半年內(nèi)曾補充維生素D治療。③半年內(nèi)可能影響維生素D水平的藥物史，如苯巴比妥、苯妥英鈉。下呼吸道定植菌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]參照氣管切開患者下呼吸道定植菌的病原學(xué)研究。

1.2 痰液標(biāo)本留取及培養(yǎng):受試者清水漱口，先自行咳痰；若無痰，予0.9%氯化鈉溶液霧化吸入排痰；若仍無痰，再逐步予3%、4%、5%氯化鈉溶液霧化吸入排痰，每次間隔7 min，直至留取痰液約10 mL。取痰過程中若出現(xiàn)不適如喘憋、氣短、呼吸困難等，立即停止霧化吸入，休息、吸氧，吸入β2受體激動劑(沙丁胺醇)。研究證實穩(wěn)定期中、重度COPD患者吸入高滲鹽水進(jìn)行痰的誘導(dǎo)是安全的[8]，對進(jìn)行誘導(dǎo)痰的患者需簽署知情同意書。將誘導(dǎo)痰液置入無菌的痰盒中，鏡下觀察痰液標(biāo)本是否合格。痰液合格標(biāo)準(zhǔn)： 每低倍視野鱗狀上皮細(xì)胞<10個、多核白細(xì)胞>25個，或二者比例<1∶2.5，不合格標(biāo)本立即重新留取痰液標(biāo)本。之后以合格痰液標(biāo)本分別接種于血平板、巧克力平板、中國藍(lán)平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，應(yīng)用常規(guī)方法分離、鑒定細(xì)菌。細(xì)菌定量≥107CFU/mL者判定為陽性。

1.3 痰液細(xì)胞因子檢測:將原痰液標(biāo)本(≥5 mL)用微量秤稱重，加4倍體積的新鮮配制的0.11%二硫蘇糖醇用吹管反復(fù)吹打，用振蕩器震蕩旋轉(zhuǎn)15 min，使之成為均勻的懸混液，將懸混液以48 μm的濾網(wǎng)過濾，再將過濾的混懸液放入離心機以790 g離心10 min，上清液分裝后-80 ℃保存，采用雙抗體夾心法檢測痰液腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)。

1.4 維生素D水平的檢測:由于25羥基維生素D半衰期較長，可以穩(wěn)定反映體內(nèi)維生素D水平，故選擇25羥基維生素D作為檢測指標(biāo)，采用ELISA法測定25-(OH)D濃度。

2 結(jié)果

2.1 COPD穩(wěn)定期患者下呼吸道細(xì)菌定植情況:96例COPD患者均完成誘導(dǎo)痰檢測，合格痰液標(biāo)本分別接種于血平板、巧克力平板、中國藍(lán)平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，應(yīng)用常規(guī)方法分離、鑒定細(xì)菌。痰液標(biāo)本陽性者37例，占38.5%，其中流感嗜血桿菌陽性率為13.5%(13例)，肺炎鏈球菌陽性率為12.5% (12例)，副流感嗜血桿菌陽性率為7.3% (7例)，銅綠假單胞菌陽性率為3.1% (3例)，卡他莫拉菌陽性率為2.1% (2例)。將37例患者納入定植組，痰液標(biāo)本未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的患者納入無定植組。其中，30%≤FEV1.0<50% COPD患者62例，該組患者中流感嗜血桿菌7例，肺炎鏈球菌8例，副流感嗜血桿菌6例，銅綠假單胞菌1例，卡他莫拉菌1例。FEV1.0<30% COPD患者34例，該組患者中流感嗜血桿菌5例，肺炎鏈球菌4例，副流感嗜血桿菌1例，銅綠假單胞菌2例，卡他莫拉菌1例。

2.2 COPD穩(wěn)定期患者定植組與無定植組基線特征:37例納入下呼吸道細(xì)菌定植組，59例納入下呼吸道細(xì)菌無定植組，2組患者年齡、病程、吸煙指數(shù)一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異(t分別為-0.54、-0.75、1.64，P均>0.05)，2組患者肺功能FEV1.0預(yù)計值(%)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.68，P>0.05)。

表1 COPD穩(wěn)定期患者與無定植組患者基線特征比較

2.3 COPD穩(wěn)定期患者定植組與無定植組觀察指標(biāo)的比較:定植組患者與無定植組患者25羥基維生素D水平分別為(16.67±3.40)ng/mL、(21.96±3.85)ng/mL，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)誘導(dǎo)痰后，定植組患者與無定植組患者痰上清液中IL-8水平分別為(318.27±49.98)pg/mL、(157.47±40.06)pg/mL，痰上清液中TNF-α水平分別為(8.96±1.67)pg/mL、(4.65±1.46)pg/mL，2組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 COPD穩(wěn)定期患者定植組與無定植組觀察指標(biāo)比較

2.4 COPD穩(wěn)定期患者25-(OH)D濃度與IL-8、TNF-α的相關(guān)性:25-(OH)D濃度與IL-8的Pearson 相關(guān)系數(shù)為-0.81，P<0.05,提示25-(OH)D濃度與IL-8呈明顯負(fù)相關(guān)；25-(OH)D濃度與TNF-α的Pearson 相關(guān)系數(shù)為-0.72，P<0.05，提示25-(OH)D濃度與TNF-α呈明顯負(fù)相關(guān)。

3 討論

維生素D缺乏在COPD患者中普遍存在，導(dǎo)致COPD患者維生素D缺乏的原因有：①飲食不當(dāng)，攝入不足，活動力下降，戶外活動減少，導(dǎo)致日光照射不足；②糖皮質(zhì)激素使用使維生素D分解代謝增強等[9]；③與維生素D結(jié)合基因的多態(tài)性相關(guān)，攜帶RS7041純合子T等位基因的人患COPD的風(fēng)險較大，并且更易表現(xiàn)出維生素D缺乏[10]。國外研究報道COPD患者維生素D缺乏與肺功能下降、生活質(zhì)量評分下降有關(guān)[11]。維生素D在慢性阻塞性肺疾病中發(fā)揮的效應(yīng)，不僅僅是對血鈣和骨骼肌的作用，還有抗菌及免疫調(diào)節(jié)作用。維生素D不足可導(dǎo)致慢性呼吸道感染和氣道細(xì)菌定植，增加細(xì)菌負(fù)荷及COPD的急性發(fā)作次數(shù)，具體機制為：維生素D是抗微生物肽如抗菌肽和防御素β基因表達(dá)的直接調(diào)控因子，能通過內(nèi)源性免疫細(xì)胞促進(jìn)抗菌肽和CD14的表達(dá)，可促進(jìn)感染恢復(fù)[12]；呼吸道上皮細(xì)胞是呼吸道病原體的主要靶細(xì)胞，在上皮細(xì)胞中維生素D調(diào)節(jié)VDR介導(dǎo)的基因表達(dá)，通過涉及TLR受體CD14和抗菌肽的機制來識別和殺死病原體[13]。

本實驗結(jié)果顯示96例COPD穩(wěn)定期患者存在下呼吸道細(xì)菌定植者有37例，定植菌常見的有流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、副流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌，與國內(nèi)外報道一致[14-15]，且國內(nèi)有研究報道COPD下呼吸道標(biāo)本中副流感嗜血桿菌的分離率有上升趨勢[16]。30%≤FEV1.0<50%的COPD穩(wěn)定期患者與FEV1.0<30%的COPD穩(wěn)定期患者相比較，下呼吸道細(xì)菌定植譜無明顯差異。定植組患者血清25羥基維生素D水平明顯低于無定植組，提示25羥基維生素D水平低下COPD患者易發(fā)生下呼吸道細(xì)菌定植，可能與維生素D調(diào)節(jié)固有免疫與獲得性免疫有關(guān)，提示維生素D缺乏可能為COPD穩(wěn)定期患者發(fā)生下呼吸道細(xì)菌定植的危險因素。慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期和急性加重期患者的IL-8水平明顯高于健康對照組，提示IL-8參與COPD的氣道炎癥[17]。

國外研究顯示IL-8、TNF-α水平可以反映COPD患者炎癥反應(yīng)和肺功能嚴(yán)重程度，從而反映疾病嚴(yán)重程度[18]，存在下呼吸道細(xì)菌定植的COPD患者的痰炎性因子明顯高于無下呼吸道細(xì)菌定植的患者。本實驗提示定植組患者痰上清液中IL-8、TNF-α水平明顯高于無定植組，與上述研究結(jié)果基本符合。

國內(nèi)有研究[19]發(fā)現(xiàn)COPD患者血清25-(OH)D水平與肺功能相關(guān)，與血清炎性因子INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10之間無線性相關(guān)。本實驗檢測痰炎性因子，發(fā)現(xiàn)25-(OH)D濃度與痰上清液中IL-8、TNF-α水平呈明顯負(fù)相關(guān)，提示25-(OH)2D3濃度影響COPD氣道炎癥因子水平，可能機制為維生素D通過與呼吸道上皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等細(xì)胞維生素D受體結(jié)合，局部產(chǎn)生1，25-(OH)2D3，下調(diào)核因子κB(NF-κB)通路，抑制IL-8、IL-12、TNF-α等炎癥介質(zhì)及基質(zhì)金屬蛋白酶的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)和肺組織破壞[20]。推測糾正維生素D缺乏可減少COPD患者下呼吸道細(xì)菌定植，發(fā)揮減輕氣道炎癥及減少COPD患者急性發(fā)作的作用。

綜上所述， COPD穩(wěn)定期患者缺乏維生素D更容易并發(fā)下呼吸道細(xì)菌定植，且維生素D水平與痰炎性因子IL-8、TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)。

[1] Sethi S，Murphy TF.Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000:a state of the art review[J].Clinical Microbiology Reviews，2001，14(2):336-363.

[2] Finney LJ，Ritchie A，Pollard E，et al.Lower airway colonization and inflammatory response in COPD:a focus on Haemophilus influenzae[J].International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2014，9(9):1119-1132.

[3] Tufvesson E，Bjermer L，Ekberg M.Patients with chronic obstructive pulmonary disease and chronically colonized with Haemophilus influenzae during stable disease phase have increased airway inflammation[J].International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2015，4(10):881-889.

[4] Zittermann A，Pilz S，Hoffmann H，et al.Vitamin D and airway infections:a European perspective[J].European Journal of Medical Research，2016，21(21):14.

[5] Leow L，Simpson T，Cursons R，et al.Vitamin D，innate immunity and outcomes in community acquired pneumonia[J].Respirology (Carlton，Vic.)，2011，16(4):611-616.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36(4)：255-264.

[7] 孫雪冬，陸地.氣管切開患者下呼吸道定植菌的病原學(xué)研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(19)：2919-2920.

[8] 辛?xí)苑?，修清玉，施毅，?支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者吸入高滲鹽水誘導(dǎo)痰的安全性和有效性觀察[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2006，19(7)：616-619.

[9] Holick MF，Chen TC.Vitamin D deficiency:a worldwide problem with health Consequences[J].The American Journal of Clinical Nutrition，2008，87(4):1080-1086.

[10] Janssens W，Bouillon R，Claes B，et al.Vtamin D deficiency is highly prevalent in COPD and correlates with variants in the vitamin D-Binding gene[J].Thorax，2010，65(3):215-220.

[11] Black PN，Scragg R.Relationship between serum 25-hydroxyvitamin D and pulmonary fuction in the third national health and nutrition examination survey[J].Chest,2005,128:3792-3798.

[12] Adams JS，Hewison M.Unexpected actions of vitamin D:new perspectives on the regulation of innate and adaptive immunity[J].Nature Clinical Practice.Endocrinology & Metabolism，2008，4(2):80-90.

[13] Hansdottir S，Monick MM，Hinde SL，et al.Respiratory epithelial cells convert inactive vitamin D to its active form:potential effects on host defense[J].Journal of Immunology (Baltimore，Md.:1950)，2008，181(10):7090-7099.

[14] Andelid K，Tengvall S，Andersson A.Systemic cytokine signaling via IL-17 in smokers with obstructive pulmonary disease:a Link tobacterial colonization [J].International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease，2015，27(10):689-702.

[15] 吳翠儀，齊亞飛.慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期患者生活質(zhì)量與下呼吸道細(xì)菌定植及炎癥反應(yīng)的相關(guān)性[J].中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2016，36(11)：5375-5377.

[16] 張桂玉，劉小平.副流感嗜血桿菌在慢性阻塞性肺疾病老年患者痰液中的分離率及耐藥性[J].中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2013，33(5)：2128-2130.

[17] 肖艷君，金保紅.慢性阻塞性肺疾病中IL-4,IL-8表達(dá)的臨床意義[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2013，35(2)：164-165.

[18] Zhang M.Li Q,zhang XY.relevance of lower airway bacterial colonization,airway inflammation,and pulmonary function in the stable stage of chronic obstructive pulmonary disease[J].European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases，2010，29(12):1487-1493.

[19] 蔣歡歡，戴玉榮.維生素D與COPD患者肺功能及血清炎癥因子的相關(guān)性[J].溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，46(2)：102-111.

[20] Sundar IK，Hwang JW，WU Shaoping，et al.Deletion of vitamin D receptor leads to premature emphysema/COPD by increased matrix metalloproteinases and lymphoid aggregates formation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2011，406(1):127-133.

AssociationofvitaminDdeficiencywithlowerairwaybacterialcolonizationandsputuminflammatoryfactorsinCOPDpatients

WANGShenlin,YANGZhao,ZHANGLiping.

DepartmentofRespiration,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002,China

YANGZhao,Email:greentree66611@sina.com

ObjectiveTo discuss the correlation between vitamin D deficiency on patients with COPD in stable phase with bacterial colonization in lower respiratory tract and sputum inflammatory factors.Methods96 cases with COPD in stable phase were selected. The venous blood was collected and level of 25-hydroxyl vitamin D in serum was determined with electrochemical method. Induced sputum was collected,and bacterial quantitative culture was preceded. 96 selected cases were divided into colonization group and non-colonization group according to existence of bacterial colonization in lower respiratory tract. Level of IL-8 and TNF-α in sputum supernatant were detected with ELISA method. Differences and correlation between 25-hydroxyl vitamin D in serum and IL-8,TNF-α in sputum supernatant in two groups of patients were analyzed.ResultsThere were 37 patients with bacterial colonization accounted for 38.54%. Level of 25-hydroxyl vitamin D of serum in colonization group was lower than that in non-colonization group. Levels of IL-8,TNF-α of sputum supernatant in colonization group were significantly higher than those in non-colonization group (P<0.05). 25-hydroxyl vitamin D in serum was negatively correlated with IL-8 and TNF-α in sputum supernatant respectively,Pearson correlation coefficients were -0.81 and -0.72 (P<0.05).ConclusionVitamin D deficiency in patients with COPD at stable phase prone to bacterial colonization in lower respiratory tract. 25-hydroxyl vitamin D in serum is negatively correlated with IL - 8 and TNF-α in sputum supernatant respectively.

Chronicobstructivepulmonarydisease;25-hydroxylvitaminD;Bacterialcolonization;Interleukine-8;Tumornecrosisfactor-α

R563

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0964

國家自然科學(xué)基金資助項目(81560014)

寧夏人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，寧夏 銀川 750002

王慎臨(1984-)，女，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師，從事呼吸內(nèi)科工作。

楊朝，Email:greentree66611@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1542.014.html

2017-06-16責(zé)任編輯馬興忠