自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療失代償期酒精性肝硬化療效分析

焦栓林，趙曉蕊，歐陽(yáng)洪，杜世奇，秦建增，王全楚

自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療失代償期酒精性肝硬化療效分析

焦栓林，趙曉蕊，歐陽(yáng)洪，杜世奇，秦建增，王全楚

目的觀察自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）聯(lián)合促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（pHGF）治療失代償期酒精性肝硬化（ALC）患者的臨床療效。方法2012年6月～2016年6月我科住院收治的67例失代償期ALC患者，34例接受常規(guī)綜合治療，33例在常規(guī)綜合治療基礎(chǔ)上接受BMSCs肝動(dòng)脈移植治療，并接受HGF注射2月。結(jié)果在治療2月末，觀察組血清TBIL、ALB、PT、HA水平分別為（55.9±12.6） μmol/L、（38.8±5.1)g/L、（13.4±3.6） s 和（222.2±61.5）ng/ml，與對(duì)照組【（66.9±11.0）μmol/L、（33.8±5.8）g/L、（15.8±3.9）s、（284.5±30.5）ng/ml，P＜0.01 或 P＜0.05】比，差異顯著。結(jié)論應(yīng)用 BMSC 移植聯(lián)合 HGF 治療 ALC 患者能較好地改善肝功能指標(biāo)。

酒精性肝硬化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素；治療

酒精性肝?。ˋLD）是目前僅次于病毒性肝炎的常見(jiàn)肝臟疾病。酒精性肝硬化（ALC）是ALD的終末階段，約8%～20%大量飲酒者最終可發(fā)展為ALC[1]。目前，對(duì)于ALC患者的治療主要依靠護(hù)肝藥物、白蛋白、利尿等常規(guī)內(nèi)科方法，在失代償期患者則需要腹水回輸或肝移植等措施處理。近年來(lái)，干細(xì)胞移植作為一種治療失代償期肝硬化的新技術(shù)被應(yīng)用于臨床。干細(xì)胞移植分為自體造血干細(xì)胞移植、自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植、異基因臍血干細(xì)胞移植和異基因臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植等。有研究表明，對(duì)于酒精性肝病引起的失代償期肝硬化，應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果較好[2，3]。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（pHGF）由于具有刺激正常肝細(xì)胞DNA合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生功能而被廣泛應(yīng)用于臨床。我們應(yīng)用BMSCs聯(lián)合pHGF治療失代償期ALC患者，觀察了臨床療效情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 2012年6月～2016年6月我科收治的67例失代償期酒精性肝硬化患者67例，男56例，女11例；平均年齡54±14歲。診斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的《酒精性肝病診療指南》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)：有超過(guò)5年的飲酒史，男性折合乙醇量≥40 g/d，女性≥20 g/d，或2周內(nèi)有大量飲酒史，折合乙醇量＞80 g/d。臨床有肝功能減退及門靜脈高壓癥的表現(xiàn)，血清酶學(xué)檢查支持失代償期ALD的診斷。經(jīng)過(guò)腹部B超、CT、MRI檢查診斷為肝硬化。納入標(biāo)準(zhǔn)：肝功能處于失代償狀態(tài)，已發(fā)生食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水等嚴(yán)重并發(fā)癥。排除合并病毒性肝炎、年齡＜18歲、存在心、肺、腎等重要臟器功能不全、凝血酶原活動(dòng)度＜40%或有嚴(yán)重出血傾向者?；颊吆炇鹬橥鈺狙芯康玫轿以横t(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 34例對(duì)照組患者接受保肝、利尿等內(nèi)科綜合治療；33例在對(duì)照組治療的基礎(chǔ)上，給予自體BMSCs和pHGF治療。在抽取骨髓術(shù)前3 d及手術(shù)前6 h分別給予人粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）150 μg，在三角肌部位行皮下注射。在無(wú)菌治療室內(nèi)，選患者髂后上棘為穿刺點(diǎn)，常規(guī)消毒鋪巾局麻后，使用18號(hào)骨髓穿刺針穿刺，抽取骨髓血100 ml，以4 000 U肝素抗凝，避免污染。采用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，每例患者提取的單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)在3.8×108～2.1×109。將骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后去除未貼附細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1 w，棄胎牛血清培養(yǎng)基，用生理鹽水洗滌2次，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，收集細(xì)胞，獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，懸浮于肝素化生理鹽水5 ml中，含細(xì)胞數(shù)為4.6×106～1.8×107個(gè)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)、鑒定示呈CD34-，CD45-，CD90+，CD44+。在數(shù)字減影血管造影技術(shù)下，經(jīng)股動(dòng)脈穿刺插管，置管于肝固有動(dòng)脈，造影，觀察肝內(nèi)血管情況及有無(wú)占位性病變。將待用的細(xì)胞懸液5 ml經(jīng)左右肝動(dòng)脈緩慢注入，并用生理鹽水5 ml沖管。術(shù)畢，拔管，穿刺點(diǎn)加壓包扎。穿刺側(cè)下肢固定6 h，術(shù)后應(yīng)用抗生素3 d，預(yù)防感染。給予促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（威海賽洛金藥業(yè)有限公司）120 mg加入5%葡萄糖注射液250 ml中靜脈滴注，1次/d，連續(xù)8 w。

1.3 觀察指標(biāo) 常規(guī)檢測(cè)血生化指標(biāo)（浙江世紀(jì)康大醫(yī)療科技有限公司）；采用日本Sysmex公司生產(chǎn)的CA-1500血凝儀測(cè)定凝血酶原時(shí)間（PT）；采用ELISA法檢測(cè)透明質(zhì)酸（HA，上海信裕生物科技有限公司）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清肝功能指標(biāo)和HA變化比較 在治療后2個(gè)月，觀察組各項(xiàng)指標(biāo)較對(duì)照組改善更明顯（P＜0.01，表1）。

表1 兩組血肝功能指標(biāo)和HA水平（±s）比較

表1 兩組血肝功能指標(biāo)和HA水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.01

例數(shù) TBIL（μmol/L) ALB（g/L）對(duì)照組 治療前 34 123.3±28.1 28.1±5.0治療后 34 66.9±11.0 33.8±5.8觀察組 治療前 33 124.5±25.9 27.7±4.8治療后 33 55.9±12.6① 38.8±5.1①PT（s）18.7±4.11 15.8±3.9 18.9±4.7 13.4±3.6①HA（ng/ml）306.8±75.4 284.5±30.5 309.6±70.0 222.2±61.5①

2.2 不良反應(yīng) 33例接受骨髓干細(xì)胞移植患者術(shù)后發(fā)生胃腸道反應(yīng)5例，發(fā)熱1例，股動(dòng)脈穿刺點(diǎn)出血形成淤斑3例，骨髓穿刺部位淤斑1例，均經(jīng)止血、對(duì)癥治療后恢復(fù)。

3 討論

肝硬化是一種臨床常見(jiàn)的慢性肝病，可由多種原因引起，肝臟呈進(jìn)行性、彌漫性、纖維性病變。主要病理學(xué)表現(xiàn)為出現(xiàn)肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死，繼發(fā)出現(xiàn)纖維組織增生及肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生，肝臟生理功能如膽汁的分泌，脂肪、糖類、蛋白質(zhì)的代謝和儲(chǔ)存，凝血因子的合成及體內(nèi)解毒等發(fā)生嚴(yán)重障礙。因此，減少肝細(xì)胞壞死、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、消除肝內(nèi)炎癥病變、減少細(xì)胞外基質(zhì)和膠原生成、促進(jìn)膠原降解、維護(hù)肝臟正常功能是治療肝硬化的關(guān)鍵。

近年來(lái)，隨著BMSCs臨床應(yīng)用的逐漸發(fā)展和對(duì)肝硬化研究的深入，采用BMSCs移植治療肝硬化成為肝硬化治療的新方法，越來(lái)越多的研究表明BMSCs移植治療失代償期肝硬化患者的安全性良好，近期療效顯著[4，5]。研究顯示BMSCs既有多向分化能力，在體外有效的刺激或體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)下可逐漸分化為具有正常功能的肝臟細(xì)胞，進(jìn)而恢復(fù)肝臟功能。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs通過(guò)刺激膠原酶活性，促進(jìn)膠原降解，抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）mRNA 的過(guò)度表達(dá)和肝細(xì)胞的凋亡，明顯降低膠原纖維、網(wǎng)狀纖維及PCⅢ、HA、LN水平，阻止肝硬化的發(fā)生、發(fā)展[8，9]。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用注射乙醇的方法復(fù)制肝損傷模型，采用BMSCs治療后動(dòng)物肝組織壞死的區(qū)域明顯小于模型組。

pHGF是由乳豬新鮮肝臟中提取出的多肽類肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子，最早作為促進(jìn)肝細(xì)胞增生的有絲分裂原被開發(fā)和純化[10]，能顯著降低PCⅢ、HA、LN水平，阻斷肝纖維化的發(fā)展。它還能溶解已形成的纖維組織，消耗肝組織中的ECM，改善肝功能。此外，pHGF能夠促進(jìn)機(jī)體肝細(xì)胞 DNA合成，從而促進(jìn)肝細(xì)胞再生，改善肝臟微循環(huán)。另一方面，pHGF通過(guò)加強(qiáng)肝內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HA的攝取和分解功能，抑制纖維細(xì)胞增生和膠原纖維形成，從而發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。

本研究對(duì)肝硬化患者治療前后各項(xiàng)血生化指標(biāo)變化情況分析顯示，血清總膽紅素和凝血酶原時(shí)間呈現(xiàn)明顯下降，血清白蛋白呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)BMSCs移植治療后患者肝功能恢復(fù)明顯，副作用少，值得臨床驗(yàn)證。

[1]Gao B，Bataller R.Alcoholic liver disease:pathogenesis and new therapeutic targets.Gastroenterology，2011，141（5）:1572-1585.

[2]Forbes SJ，Newsome PN.New horizons for stem cell therapy in liver disease.J Hepatol，2012，56（2）:496-499.

[3]Zhang Z，Wang FS.Stem cell therapies for liver failure and cirrhosis.J Hepatol，2013，59（1）:183-185.

[4]王方，云升皓，周新人，等.經(jīng)肝動(dòng)脈自體骨髓或臍帶血干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化患者的安全性和近期療效比較.實(shí)用肝臟病雜志，2014，17（4）:356-359.

[5]沈建坤，鄭聯(lián)坵，潘興南，等.自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療失代償期酒精性肝硬化療效分析.實(shí)用肝臟病雜志，2015，18（6）:628-632.

[6]郭屏，王淑平，劉丹萍.川芎嗪聯(lián)合促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素治療慢性乙型病毒性肝炎肝纖維化療效觀察.中國(guó)藥房，2007，18（8）:601-603.

[7]Matsuda Y，Matsumoto K，Yamada A，et al.Preventive and therapeutic effects in rats of hepatocyte growth factor infusion on liver fibrosis/cirrhosis.Hepatology，1997，26（1）:81-89.

[8]吳理茂，李連達(dá)，劉紅，等.自體脊髓干細(xì)胞移植與歸元方連用治療急慢性肝損傷實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)工程科學(xué)，2004，6（8）:34-38.

[9]Yang L，Inokuchi S，Roh YS，et al.Transforming growth factor-β signaling in hepatocytes promotes hepatic fibrosis and carcinogenesis in mice with hepatocyte-specific deletion of TAK1.Gastroenterology，2013，144（5）:1042-1054.

（收稿：2017-01-19）

（本文編輯：陳宗炳）

Efficacy ofautologousbone marrow mesenchymalstem cellstransplantation in treatmentofpatientswith decompensated alcoholic livercirrhosis

JiaoShuanlin，ZhaoXiaorui，Ouyang Hong，etal.DepartmentofHepatobiliary Medicine，153th Hospital of PLA，Zhengzhou 450007，Henan Provinc

Alcoholic liver cirrhosis；Bone marrow mesenchymal stem cells；Hepatocyte growth factor；Therapy

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.038

450007鄭州市 解放軍第153醫(yī)院肝膽內(nèi)科

焦栓林，男，52歲，大學(xué)本科，主任醫(yī)師。主要從事重癥肝病及晚期肝硬化的診斷與治療研究。E-mail：jiaoshuanlin@126.com